桐花樹(shù)耐鹽基因的克隆、功能表達(dá)及其適應(yīng)性進(jìn)化的研究.pdf

1、影響農(nóng)作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的最主要因素是環(huán)境脅迫，其中又以鹽脅迫和干旱脅迫最為嚴(yán)重。解決這一問(wèn)題最直接的途徑是利用基因工程手段，培育耐鹽作物品種。由于鹽生植物可能具有進(jìn)化上與非鹽生植物截然不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)構(gòu)和調(diào)節(jié)控制機(jī)制，因此，分離識(shí)別鹽生植物耐鹽相關(guān)基因的研究不僅可以豐富我們對(duì)于植物耐鹽機(jī)制的認(rèn)識(shí)，而且可以為開(kāi)發(fā)利用鹽生植物耐鹽基因資源，培育耐鹽作物品種奠定基礎(chǔ)，目前分離識(shí)別鹽生植物耐鹽相關(guān)基因已逐漸成為國(guó)際上植物耐鹽領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

2、 提取高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行植物耐鹽基因表達(dá)研究的前提。紅樹(shù)所含的大量次生物質(zhì)給RNA提取造成了較大困難。經(jīng)過(guò)摸索，本文發(fā)展了一項(xiàng)低成本，高效率且無(wú)需液氮的RNA提取方法。用該法制得的總RNA能夠滿足后續(xù)多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。在此基礎(chǔ)上，本文首次構(gòu)建了紅樹(shù)植物桐花樹(shù)(Aegicerascorniculatum)3％海水脅迫下的正向抑制性扣除文庫(kù)，一共獲得602個(gè)質(zhì)粒，整理測(cè)序結(jié)果共獲得575條表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)。并利用Mi

3、croarray技術(shù)對(duì)該文庫(kù)中566個(gè)克隆子進(jìn)行了500mMNaCl脅迫2小時(shí)，5小時(shí)兩個(gè)時(shí)間段基因表達(dá)譜的分析。共鑒定出68個(gè)至少在兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)中發(fā)生了差異表達(dá)的克隆子。其中63個(gè)為上調(diào)表達(dá)的克隆子，5個(gè)為下調(diào)表達(dá)的克隆子。這一結(jié)果與我們構(gòu)建的是正向文庫(kù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相吻合。對(duì)該文庫(kù)克隆子進(jìn)行序列和表達(dá)模式分析表明：桐花樹(shù)在受到鹽脅迫時(shí)，既采取了一些與甜土植物相同的應(yīng)答機(jī)制，又采取了一些特有的抗鹽途徑。為深入了解桐花樹(shù)中鹽誘導(dǎo)基因的功能

4、，本文利用RACE技術(shù)克隆了5個(gè)桐花樹(shù)鹽誘導(dǎo)基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并選取了AcP5CS和AcCPI兩個(gè)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥研究。轉(zhuǎn)基因擬南芥研究結(jié)果表明：轉(zhuǎn)AcP5CS和轉(zhuǎn)AcCPI基因植株均獲得了比對(duì)照組更高的抗鹽能力。且在5種鹽度下轉(zhuǎn)AcCPI基因植株的生長(zhǎng)狀況均優(yōu)于轉(zhuǎn)AcP5CS基因植株和對(duì)照組。 為了解桐花樹(shù)抗鹽基因AcP5CS是否存在適應(yīng)性進(jìn)化，本文擴(kuò)增了桐花樹(shù)以及紫金?？破渌麑俟?0個(gè)物種的P5CS基因的部分CDS

5、序列，兩兩計(jì)算了Ks-Ka的值。結(jié)果表明：所檢測(cè)的20個(gè)物種的P5CS在其所研究的序列內(nèi)均未發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化。這項(xiàng)結(jié)果與自然界只在極少數(shù)基因發(fā)現(xiàn)了適應(yīng)性進(jìn)化的事實(shí)相一致。本論文的研究工作改進(jìn)了現(xiàn)有RNA提取技術(shù)，對(duì)紅樹(shù)植物鹽誘導(dǎo)SSH文庫(kù)的構(gòu)建和芯片點(diǎn)制、雜交，克隆全長(zhǎng)cDNA,功能鑒定等實(shí)驗(yàn)功能基因組學(xué)的研究取得了初步結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一批新的抗逆基因，為進(jìn)一步研究其基因結(jié)構(gòu)和時(shí)空表達(dá)譜及其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，即為實(shí)驗(yàn)室建立了紅樹(shù)植物功能基因