胃癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中Vav1表達(dá)及與腫瘤耐藥關(guān)系的研究.pdf

1、目的：據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)胃癌位居惡性腫瘤第4位，每年新發(fā)胃癌約90余萬人，死亡約70萬人。我國(guó)屬于胃癌的高發(fā)地區(qū)，每年新發(fā)胃癌患者人數(shù)約占世界范圍內(nèi)的42％。胃癌患者早期癥狀及體征不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已處于進(jìn)展期，甚至晚期，手術(shù)治療輔以化療已經(jīng)成為最常見的治療方式。合理化療可以提高胃癌患者治療療效，并延長(zhǎng)生存時(shí)間。腫瘤的多藥耐藥性（Multiple drug resistance, MDR）是影響患者治療療效的關(guān)鍵因素。MDR包括原發(fā)性耐

2、藥和繼發(fā)性耐藥，其作用機(jī)制極度復(fù)雜，由多因素、多步驟參與，并且轉(zhuǎn)移過程中腫瘤耐藥性會(huì)發(fā)生異質(zhì)性改變。通過對(duì)多藥耐藥蛋白1（Multidrug resistance MDR1）/P-糖蛋白（P-glycoprotein P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（Multidrug resistance protein1 MRP1）、胸苷酸合成酶（Thymidylate synthase TS）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-trans

3、ferase GST-π）等多個(gè)耐藥蛋白以及與之相關(guān)的分子機(jī)制的深入研究是逆轉(zhuǎn)化療失敗的關(guān)鍵。因此積極尋找新的胃癌耐藥相關(guān)因子有重要意義。Vav1是一種原癌基因。它具有鳥苷酸交換因子（GEF）活性，屬于 Db1家族中的一員，已有研究發(fā)現(xiàn) Vav1在多種惡性腫瘤中有表達(dá)，并在腫瘤局部進(jìn)展與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著非常重要的作用，是惡性腫瘤患者預(yù)后不良的標(biāo)志之一。研究發(fā)現(xiàn)[1] Vav1能夠顯著上調(diào)抗凋亡基因 Bcl-2的轉(zhuǎn)錄活性，從而使細(xì)胞免

4、于凋亡，Vav1的GEF活性是上調(diào)Bcl-2所必須的。而 Bcl-2可通過協(xié)調(diào) P-gp增加腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的耐藥[2]，由此可推測(cè) Vav1與腫瘤的 MDR可能存在較密切關(guān)系。
　　本研究以42例進(jìn)展期胃癌原發(fā)病灶組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qPCR）檢測(cè)Vav1的mRN

5、A在兩種不同胃癌組織中的表達(dá)差異及關(guān)系。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè) Vav1、MDR1/P-gp、MRP1、TS、GST-π在胃癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)，并對(duì)Vav1與四種耐藥蛋白在胃癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行研究。采用四氮唑藍(lán)法（MTT）檢測(cè)不同機(jī)制化療藥（氟尿嘧啶5-FU、足葉乙苷 VP-16、紫杉醇 PTX、順鉑 CDDP、氨甲喋呤 MTX）對(duì)胃癌原發(fā)灶和相應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)胞的抑制情況，并進(jìn)行對(duì)比分析，探討 Vav1與胃癌M

6、DR的關(guān)系及意義。
　　方法：
　　收集42例進(jìn)展期患者胃癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)新鮮組織標(biāo)本及相應(yīng)患者的中性甲醛所固定胃癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，在mRNA水平檢測(cè) Vav1在胃癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)，另采用免疫組織化學(xué)染色法在蛋白水平檢測(cè) Vav1及相關(guān)耐藥蛋白（MDR1/P-gp、MRP1、TS、GST-π）在胃癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)。通過做相關(guān)分析，明確 Vav1與腫瘤耐藥相關(guān)蛋白的關(guān)系及意義

7、。采用四氮唑藍(lán)法（MTT）檢測(cè)化療藥（氟尿嘧啶5-FU、足葉乙苷 VP-16、紫杉醇 PTX、順鉑 CDDP、氨甲喋呤 MTX）對(duì)5組細(xì)胞體外化療藥敏性。所得數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料的比較采用 t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性的分析應(yīng)用 spearman相關(guān)分析。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1 Vav1蛋白與mRNA在胃癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)強(qiáng)度差異以及相關(guān)性：
　　V

8、av1蛋白在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)明顯高于胃癌組織（χ2=5.927，P=0.015），在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織與胃癌原發(fā)灶組織中 Vav1蛋白表達(dá)具有明顯相關(guān)性（r=0.359，P=0.019）。Vav1 mRNA在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)高于胃癌組織（0.379±0.233 vs0.123±0.081，t=7.818， P=0.000），且二者之間有明顯相關(guān)性（r=0.418，P=0.006）。
　　2 MDR1/P-gp、TS、MRP

9、1、GST-π蛋白在胃癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)以及相關(guān)關(guān)系：
　　MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)明顯高于胃癌組織（χ2=5.974；χ2=7.683；χ2=4.421；χ2=4.266， P=0.015, P=0.006；P=0.035；P=0.039）。在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織與胃癌原發(fā)灶組織間 MDR1/P-gp、MRP1、GST-π蛋白表達(dá)具有明顯的相關(guān)性（ r=0.380；r=0.33

10、6；r=0.311， P=0.013， P=0.030；P=0.045）；在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織與胃癌原發(fā)灶組織中 TS蛋白無明顯相關(guān)關(guān)系（ r=0.28， P=0.072）。
　　3在胃癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織蛋白水平 Vav1與 MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π間的相關(guān)關(guān)系。
　　胃癌組織中 Vav1與 MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π的表達(dá)，在蛋白水平呈正相關(guān)關(guān)系（ r=0.378；r=0.440；r=

11、0.437；r=0.348， P=0.014；P=0.004；P=0.004；P=0.024）。
　　轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中 Vav1與 MDR1/P-gp、MRP1在蛋白水平的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（ r=0.365；r=0.335， P=0.017；P=0.030）；而 Vav1與TS、GST-π在胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中蛋白表達(dá)水平無明顯相關(guān)關(guān)系（r=0.229；r=0.023， P=0.136；P=0.883）。
　　45-FU、V

12、P-16、PTX、CDDP、MTX在胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶之間體外化療藥敏性比較
　　胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的化療藥物抑制率比較， VP-16對(duì)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)瘤細(xì)胞抑制率明顯較原發(fā)灶高（ t=-2.28， P=0.025）；而5-FU、PTX、CDDP、MTX，對(duì)胃癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的瘤細(xì)胞抑制率之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ t=-1.23；t=-0.94；t=1.06；t=0.69, P=0.223；P=0.352；P=0.2

13、91；P=0.490）。
　　5 Vav1、MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白在胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶表達(dá)與相應(yīng)組織中瘤細(xì)胞體外化療藥敏感性關(guān)系
　　胃癌原發(fā)灶中 Vav1弱表達(dá)組對(duì)5-FU、PTX的瘤細(xì)胞抑制率明顯高于強(qiáng)表達(dá)組（t=2.34,t=2.14, P=0.024；P=0.038）。P-gp強(qiáng)表達(dá)組對(duì)5-FU的瘤細(xì)胞抑制率明顯低于弱表達(dá)組，（t=2.71, P=0.010）。TS強(qiáng)表達(dá)組對(duì)5-FU

14、、CDDP的瘤細(xì)胞抑制率明顯低于低表達(dá)組（ t=4.40； t=2.19, P=0.000；P=0.019）。MRP1強(qiáng)表達(dá)組對(duì)5-FU、PTX、CDDP的瘤細(xì)胞抑制率明顯低于弱表達(dá)組（t=2.12；t=2.09；t=4.26, P=0.040；P=0.043；P=0.000）。GST-π強(qiáng)表達(dá)組對(duì)5-FU、PTX、CDDP的瘤細(xì)胞抑制率明顯低于弱表達(dá)組（ t=2.17；t=2.48；t=2.13, P=0.036；P=0.017；P=

15、0.040）。
　　淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中 Vav1弱表達(dá)組對(duì)5-FU、CDDP的瘤細(xì)胞抑制率明顯高于強(qiáng)表達(dá)組（t=2.10；t=2.37, P=0.042；P=0.023）。P-gp強(qiáng)表達(dá)組對(duì)5-FU、PTX、CDDP的瘤細(xì)胞抑制率明顯低于弱表達(dá)組(t=2.34；t=2.05；t=2.11， P=0.025；P=0.047；P=0.041)。TS強(qiáng)表達(dá)組對(duì)5-FU、PTX的瘤細(xì)胞抑制率明顯低于弱表達(dá)組（ t=2.13；t=2.27， P

16、=0.039；P=0.029）。MRP1強(qiáng)表達(dá)組對(duì)5-FU的瘤細(xì)胞抑制率明顯低于弱表達(dá)組（t=3.85，P=0.000）。GST-π強(qiáng)表達(dá)組對(duì) CDDP的瘤細(xì)胞抑制率低于低表達(dá)組（t=3.16，P=0.003）。
　　結(jié)論:
　　1 Vav1蛋白質(zhì)和mRNA在胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)水平明顯高于胃癌組織，表明 Vav1在胃癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)病灶之間存在異質(zhì)性，提示 Vav1可能參與了胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程，是胃癌進(jìn)展的一個(gè)重要

17、因素。
　　2 MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯低于轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)病灶，說明耐藥蛋白在胃癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中存在異質(zhì)性表達(dá)，提示轉(zhuǎn)移病灶耐藥性更強(qiáng)以及有更強(qiáng)的進(jìn)展趨勢(shì)。
　　3胃癌組織的Vav1表達(dá)水平與MDR1/P-gp、MRP1、TS、GST-π呈正相關(guān)性，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中 Vav1表達(dá)水平與 MDR1/P-gp、MRP1呈正相關(guān)關(guān)系，提示胃癌組織中 Vav1參與的侵襲、轉(zhuǎn)移在疾病進(jìn)展過程

18、可能與胃癌耐藥分子網(wǎng)絡(luò)存在著交叉，或通過某種調(diào)控機(jī)制共同促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。
　　4通過體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì) VP-16敏感性明顯高于原發(fā)灶，而對(duì)5-FU、PTX、CDDP、MTX的藥敏性不同，提示胃癌轉(zhuǎn)移過程中耐藥性發(fā)生了異質(zhì)性改變，以原發(fā)灶的耐藥結(jié)果并不能全面、準(zhǔn)確地推斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的藥敏性。
　　5在胃癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)胞中 MDR1/P-gp、MRP1、TS、GST-π的表達(dá)對(duì)5-FU、VP-16、PT

19、X、CDDP、MTX敏感性不同，提示胃癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中化療藥敏性存在異質(zhì)性改變。只以任何一種 MDR相關(guān)因子
　　反映胃癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的藥敏性均是不全面的。在胃癌原發(fā)灶中 Vav1表達(dá)對(duì)5-FU敏感性降低，而在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中對(duì) CDDP的敏感性降低，提示 Vav1可能參與了 MDR過程，并在某種程度上可預(yù)測(cè) MDR，但在胃癌轉(zhuǎn)移過程中耐藥性發(fā)生了改變。對(duì) VP-16、CDDP、MTX敏感性無顯著差異，提示Vav1只是胃癌MDR調(diào)節(jié)