基于對蛋白質(zhì)色氨酸殘基熒光猝滅的均相親和分析方法及其應用.pdf

1、以蛋白質(zhì)中色氨酸或酪氨酸殘基為熒光共振能量轉(zhuǎn)移供體,熒光探針作為FRET接受體可進行均相親和分析;FRET探針需包含作為蛋白色氨酸接受體的熒光團和蛋白特異性配體兩部分;形成復合物后激發(fā)色氨酸測定FRET效應可確定復合物的量，從而建立對應的均相親和分析系統(tǒng)。理論上，此法可競爭結(jié)合測定非熒光配體、非競爭結(jié)合測定對應蛋白、滴定分析標定對應蛋白含量、競爭結(jié)合測定非熒光配體親和力等。這些應用的關(guān)鍵是獲得所需FRET探針。
　　本文第一部分建

2、立了一種均相測定白蛋白(ALB)含量的熒光新方法。該法利用熒光探針8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)與白蛋白在特定條件下的高親和力結(jié)合，在280 nm和350 nm波長激發(fā)下同時測定形成的復合物在470 nm的熒光發(fā)射信號來測定血清中白蛋白的含量。ANS是白蛋白的非特異性熒光配體，親和力中等;在結(jié)合的ANS和白蛋白色氨酸殘基之間的FRET現(xiàn)象早已報道。ANS與ALB復合物有適度的量子產(chǎn)率，但ANS在緩沖水溶液中的信號可忽略，故游離ANS在2

3、80nm處激發(fā)不會造成高本底，可測定白蛋白和ANS復合物的熒光。ANS與白蛋白的結(jié)合涉及疏水和靜電相互作用，用低離子強度緩沖液和稍低pH值可提高ANS與白蛋白親和力。用Matlab擬合ANS滴定ALB和ALB滴定ANS曲線得到解離常數(shù)(Kd)接近0.15μM。此外，280nm激發(fā)下復合物中FRET效應進一步提高ANS作為生物傳感器測定白蛋白靈敏度和選擇性。通過對50例白蛋白濃度15～55 g/L臨床血清標本測定，變異系數(shù)為5％以下。同時

4、新方法對于常見的球蛋白，對潛在的干擾物青霉素和肝素，以及其他常見的干擾物質(zhì)有更好的抗干擾能力。同時結(jié)果顯示在280或350納米激發(fā)，與溴甲酚綠法(BCG)呈良好的相關(guān)性，且Bland-Altman分析證明了兩種的一致性;與免疫比濁法測定結(jié)果相關(guān)性很高，且Bland-Altman分析證明二者一致。特殊的是，280 nm激發(fā)產(chǎn)生FRET效應對應的方法抗干擾能力、與免疫比濁法測定結(jié)果的一致性還高于BCG法?？梢?，利用與蛋白結(jié)合產(chǎn)物的量子產(chǎn)率增

5、加效應及復合物內(nèi)部的FRET效應設(shè)計檢測特定蛋白的熒光探針，其測定的特異性和靈敏度更好。
　　本文第二部分建立了一種基于對單抗的色氨酸熒光淬滅作用，從頭校準單克隆抗體含量的新方法。單克隆抗體（單抗）是生物分析必不可少的生物材料。在實際應用中，單克隆抗體的含量應準確校準跟蹤。六組氨酸(6His)被廣泛用于蛋白質(zhì)和融合表達及其單克隆抗體(單抗-6His)是用于檢測的6His-標簽的目的蛋白。單抗-6His中使用的6His滴定曲線作為非

6、熒光探針可以記錄在340nm處熒光。另一方面，丹磺酰胺是色氨酸殘基的受體，而丹磺酰的6His(DNS-6His)作為FRET探針記錄滴定曲線在540 nm熒光發(fā)射或340hm熒光猝滅，單抗-6His中的滴定曲線的擬合記錄為熒光在340 nm處具有任一探針遇到不收斂為單抗-6His中的量化。這兩種類型的單克隆抗體的探頭可以有足夠的純度進行跟蹤。根據(jù)單克隆抗體激發(fā)波長為280 nm的兩種類型的探針的滴定曲線，可以在340 nm處記錄熒光，且

7、通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的探針也可記錄探針的熒光，滴定曲線的分析可以校正結(jié)合位點單抗含量，從而證明這種方法是有效和普遍適用的。
　　本文第三部分設(shè)計合成低親和力鏈親和素熒光探針基于FRET和競爭結(jié)合測定生物素。鏈霉親和素（Streptavidin，SA）與生物素的解離常數(shù)為10-15M，親和力是抗原抗體反應（10-5～10-11M）的1萬倍以上。設(shè)計并合成了四種低親和力鏈親和素熒光探針，通過聚乙二醇單甲醚(mPEG)或季胺堿陽性離子的