寶山堇菜鎘耐性相關(guān)基因的克隆及大環(huán)寡肽前體基因的功能研究.pdf

1、寶山堇菜(Violabaoshanensis)是在中國南方發(fā)現(xiàn)的一種新的Cd超富集植物。從寶山堇菜中克隆Cd耐性相關(guān)基因的目的在于：(1)揭示寶山堇菜對Cd解毒和轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制；(2)提供更多候選基因用于改良植物的Cd耐性和富集性能。本論文研究工作主要包括：(1)調(diào)查寶山堇菜在不同生境下的重金屬積累特征；(2)采用抑制消減雜交技術(shù)調(diào)查Cd處理(300μMCd，48h)寶山堇菜根的轉(zhuǎn)錄剖面(profile)，并對分離基因進(jìn)行表達(dá)分析；(3

2、)對部分基因進(jìn)行全長cDNA擴(kuò)增和原核表達(dá)分析；(4)對七個(gè)大環(huán)寡肽前體基因進(jìn)行表達(dá)模式分析和酵母表達(dá)分析。取得的主要研究結(jié)果如下： 1.野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，四個(gè)樣點(diǎn)的寶山堇菜地上部的Cd含量均高于100mg/kg，從樣點(diǎn)1到樣點(diǎn)4依次為826，230，32l和167mg/kg。樣點(diǎn)3寶山堇菜Pb平均含量高于1000mg/kg，地上部和地下部的含量分別為2041和1305mg/kg。寶山堇菜地上部和根部的重金屬含量與土壤總量顯著相關(guān)(

3、P<0.05，部分為P<0.01)。寶山堇菜Cd積累量與DTPA提取態(tài)Cd和土壤總Cd相關(guān)性系數(shù)分別為0.89(p<0.01)和0.68(p<0.01)。 2.溶液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，在30μMCd(12d)處理?xiàng)l件下，寶山堇菜根部和地上部干重中的Cd積累量分別為27和352mg/kg；在300μMCd(12d)處理?xiàng)l件下，寶山堇菜根部和地下部干重中的Cd積累量分別為602和2595mg/kg，說明寶山堇菜能超富集Cd。100μMCd

4、(40d)處理對寶山堇菜的生長沒有明顯的影響，說明寶山堇菜具有較強(qiáng)的Cd耐受能力。 3.從300μMCd處理寶山堇菜根中鑒定了43個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。根據(jù)同源物的功能可將分離基因歸為6類：抗氧化酶(6個(gè)EST)、蛋白代謝(9個(gè)EST)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(5個(gè)EST)、植物防衛(wèi)肽(5個(gè)EST)、其它代謝(5個(gè)EST)以及功能未知蛋白(12個(gè)EST)。大部分分離基因?yàn)榻M成型表達(dá)，再次證實(shí)Cd超富集植物的Cd耐性主要依賴于植物的組成型防

5、衛(wèi)。 4.利用SMART-RACE技術(shù)對12個(gè)EST的cDNA末端進(jìn)行了擴(kuò)增，3’-RACE延伸cDNA末端的長度在97-550bp之間，5’-RACE則在37-1192bp之間。通過裝配序列的閱讀框分析以及編碼蛋白的同源比對分析，鑒定了9個(gè)具有完全編碼區(qū)的序列。其中5個(gè)序列編碼不同的大環(huán)寡肽前體蛋白(Cyclotideprecursor，CP)，分別命名為VbCP1、VbCP2、VbCP3、VbCP4和VbCP5。另外4個(gè)序列

6、分別編碼小分子脅迫蛋白、GDP甘露糖焦磷酸化酶、翻譯起始因子Suil和一個(gè)半胱氨酸豐富的小蛋白，依次命名為VbSP1、VbGmapase、VbSuil和Vb40。 5.將5個(gè)VbCP基因(VbCP1-VbCP5)和VbGmpase轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中，VbCP1、VbCP3、VbCP4、VbCP5和VbGmpase的轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出較對照(pQE40轉(zhuǎn)化子)更強(qiáng)的Cd耐性。此外，重組蛋白VbCP4和VbGmpase在大腸桿菌M

7、15[pREP4]中也獲得了穩(wěn)定的高表達(dá)。 6.分析5個(gè)VbCP基因(VbCP1-VbCP5)在寶山堇菜中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些基因在對照和Cd處理根中高表達(dá)，在葉中的表達(dá)相對較弱。電泳分析發(fā)現(xiàn)，在VbCP5的葉RT-PCR產(chǎn)物中，出現(xiàn)兩組較VbCP5更長的DNA帶。這兩組DNA帶被進(jìn)一步鑒定為兩個(gè)新的CP基因VbCP6和VbCP7，VbCP6和VbCP7主要在葉中表達(dá)，在根中未檢測到它們的表達(dá)。 7.本研究定義大環(huán)寡肽的第1

8、個(gè)Cys到第6個(gè)Cys之間的序列為六半胱氨酸框(Sixcysteineframe，SCF)。7個(gè)VbCP基因(VbCP1-VbCP7)編碼的VbCP蛋白分別含有一個(gè)SCF(VbCP1-VbCP5)、兩個(gè)SCF(VbCP6)或三個(gè)SCF(VbCP7)：7個(gè)VbCP蛋白的SCF長度包括4種類型：22aa(VbCP6和VbCP7)、24aa(VbCP1-VbCP3)、25aa(VbCP4)和28aa(VbCP5)。將Genbank蛋白數(shù)據(jù)庫中

9、的66個(gè)大環(huán)寡肽和26個(gè)CP進(jìn)行SCF分析發(fā)現(xiàn)，VbCP4和VbCP5分別是僅有的含25-aa-SCF和28-aa-SCF的CP蛋白，VbCP6是僅有的含兩個(gè)22-aa-SCF的CP蛋白，因而VbCP4、VbCP5和VbCP6代表了CP蛋白的三種新類型。大環(huán)寡肽和CP的SCF長度很少高于25aa，因而含28-aa-SCF的VbCP5也代表了一種稀有的CP類型。 8.將七個(gè)VbCP基因(VbCP1-VbCP7)轉(zhuǎn)至釀酒酵母YL36