寶山堇菜和東南景天再生體系建立及Pb耐性相關基因克隆.pdf

1、寶山堇菜(Viola baoshannensis)和東南景天(Sedum alfrediii)分別是近年來在我國境內(nèi)發(fā)現(xiàn)Pb/Cd和Zn/Cd超富集植物，在重金屬污染土壤的植物修復和植物對重金屬富集機理研究領域有廣泛的應用潛力。本研究利用組織培養(yǎng)技術建立了東南景天和寶山堇菜的微繁體系，并用水溶液培養(yǎng)法檢驗再生寶山堇菜組培苗的Pb、Cd超富集特性。為探討東南景天對Zn和Cd耐性和富集的生理機制，本研究以兩個生長于浙江(ZJ)、湖南(HN)

2、Pb/Zn礦的礦區(qū)東南景天種群和一個生長于廣東(GD)正常土壤的非礦區(qū)東南景天種群為實驗材料，運用溶液培養(yǎng)法，比較了三個種群對重金屬Zn和Cd耐性、吸收和富集能力的差異；另一方面，為了解寶山堇菜對Pb的耐性/富集分子機制，本研究分別采用抑制消減雜交技術(suppression subtractive hybridization，SSH)和cDNA-AFLP(complementary deoxyrilbonucleic acid amp

3、lified fi-agment length polymorphism)技術，篩選了寶山堇菜根在高、低濃度Pb誘導下差異表達的基因片段，進而對與Pb耐性與富集相關的基因克隆片段(expressed sequence tags，ESTs)進行半定量RT-PCR和Northom雜交驗證。本研究的主要結(jié)果總結(jié)如下： 1.東南景天種群間對Zn和Cd耐受和富集能力表現(xiàn)顯著差異。在1/10 Hoagland營養(yǎng)液中，來自礦區(qū)的HN和z

4、，種群在Zn(2.5-40 mg 1<'-1>)和Cd(0.25-2 mg 1<'-1>)處理中均未表現(xiàn)明顯受傷害癥狀；而GD種群在zn和Cd濃度分別為5。mg 1<'-1>和0.25 mg 1<'-1>時，表現(xiàn)明顯受傷害癥狀。這表明，與非礦山種群(GD)相比，東南景天的礦山種群(ZJ和HN)已具有很強的Zn、Cd耐性。當溶液中Zn<'2+>濃度為20 mg 1<'-1>時，ZJ種群莖中zn含量達到最高值，為10136 nag kg<'

5、-1>(干物質(zhì)，DW，下同)；當溶液中Zn<'2+>濃度為10 mg 1<'-1>時，ZJ種群葉中Zn含量達到最高值，為7792 mg kg<'-1>。20 mg 1<'-1>Zn處理下，HN種群莖葉中Zn含量最大，分別為9858 mg kg<'-1>和8156 mg<'-1>。GD種群莖葉中Zn含量均低于900 mg kg<'-1>。當溶液中Cd<'2+>濃度為2 mg 1<'-1>時，ZJ種群莖葉中Cd含量最高，均超過5000 mg

6、 kg<'-1>；此處理下，HN種群莖葉中Cd含量也最高，分別為4387 mg kg<'-1>和1181 mg kg<'-1>；而GD種群Cd含量不超過300 mg kg<'-1>。這表明，在Zn/Cd富集能力方面，東南景天的礦山種群強于非礦山種群，其中以ZJ種群的富集能力最強。此外，所有重金屬處理下，zJ和HN種群莖重金屬含量/根重金屬含量即莖部轉(zhuǎn)運系數(shù)(TF,translocation-factor)總大于1，表明ZJ和HN種群的東

7、南景天具有超富集Zn、Cd的能力。 2.東南景天的ZJ種群的葉外植體接種在含10μM NAA+10μM BA的MS基本培養(yǎng)基上，成功誘導出愈傷組織和叢生芽，平均每外植體誘導出的芽數(shù)超過10，初步建立了高繁殖系數(shù)的東南景天體外繁殖體系，但再生芽的生根及組培再生苗的移栽尚有一定困難。寶山堇菜葉外植體接種在含(2.5-10)μM NAA+(2.5-10)μM BA或(2.5-10)μMIBA+(2.5-10)μM BA的MS基本培

8、養(yǎng)基上后，能成功誘導出叢生芽。2.5μM IBA+2.5μM BA和10μM IBA+5μM BA激素組合對寶山堇菜從生芽的誘導效果最好，平均每外植體誘導出的芽數(shù)分別為22.4和21.7。誘導出的芽在1/2MS培養(yǎng)基上成功長出根，組培再生苗能成功移植到土壤中，形態(tài)上沒有任何變異，說明本次研究成功建立寶山堇菜的體外繁殖體系。 3.對寶山堇菜組培苗的重金屬超富集特性進行水培驗證，所有Cd處理(90-450μM)下，外植體再生苗和

9、種子萌發(fā)苗的干重生物量、地上和地下部分富集的Cd含量均無顯著差異。在所有Cd處理下，兩種來源的寶山堇菜苗生長未受抑制，地上部分積累的Cd均超過100 mgkg<'-1>，在450μM Cd處理時，甚至超過6500 mgkg<'-1>，且根部富集的Cd總小于地上部分。這充分證明組培寶山堇菜苗未發(fā)生變異，和種子萌發(fā)寶山堇菜一樣仍具有Cd超富集特性。Pb處理(100-1000μM)下，外植體再生寶山堇菜地上部分積累的Pb均超過1000 mg

10、kg<'-1>，在1000μM Pb處理時，外植體再生寶山堇菜地上部分積累的Pb最高為19543 mg kg<'-1>。Pb轉(zhuǎn)運系數(shù)(TF，地上部分Pb含量/根Pb含量)變化范圍是0.2-0.3，符合Pb超富集植物標準，和以往對野外采集寶山堇菜進行的水培試驗結(jié)果相符，說明組培寶山堇菜苗沒有發(fā)生變異，仍具有Pb超富集特性。 4.為篩選高濃度Pb脅迫下寶山堇菜根中特異表達基因，以組培再生寶山堇菜為材料，以300μM Pb(NO<

11、,3>)<,2>處理48 h的寶山堇菜根部mRNA為檢測子(tester)，對照組根mRNA為驅(qū)趕子(driver)，利用SSH技術，構(gòu)建寶山堇菜差異表達cDNA文庫，獲得27個有意義的無重復EST克隆片段，大小區(qū)間為120-890 bp。根據(jù)其功能，分為5類：1)抗氧化相關；2)脅迫蛋白；3)信號轉(zhuǎn)導相關；4)代謝相關；5)未知功能片斷。為篩選低濃度Pb脅迫下寶山堇菜根中特異表達基因，通過cDNA-AFLP方法得到24個大小區(qū)間為15

12、0-500 bp無重復的有意義EST克隆片段，這些片斷在60μM Pb(NO<,3>)<,2>處理48 h的寶山堇菜根部上調(diào)表達。根據(jù)其功能，這些克隆片段也可分為5類，但和通過SSH方法篩選出的300μM Pb脅迫下根中差異表達的克隆片段基本沒有重復。 5.不同濃度(對照、60、300、600μM Pb處理)、不同時間(對照、1 d、2 d、7 d)和不同處理(對照、Cd、Na、H<,2>O<,2>)下，對感興趣EST克隆片

13、段進行半定量RT-PCR和Northem雜交分析。結(jié)果顯示與Lycopersicon esculentum木葡聚糖內(nèi)源轉(zhuǎn)糖基酶(xyloglucan endotransglycosylase，XTH)基因相似性達92﹪的PS10號克隆片段在寶山堇菜根和葉中的表達量隨著Pb處理濃度延長逐漸增加，在300μM Pb處理時最大，在600μMPb處理時略有下降。處理濃度為300μM Pb時，PS10號克隆在寶山堇菜根和葉中的表達量隨著Pb處理時

14、間延長而增加，在處理7 d時最大。與Arabidopsis thaliana GTP結(jié)合蛋白基因(GTP binding mRNA)相似性達84﹪的PS13號克隆在寶山堇菜根中的表達量隨著Pb處理濃度增加和處理時間(300μM Pb脅迫下)延長而逐漸增加，但在葉中表達量變化不明顯。與Solanum tuberosum類甜味蛋白(thaumatin-like protein)基因相似性達85﹪的PA8號克隆在寶山堇菜根中，隨Pb脅迫濃度的

15、增加，基因的表達量增加，在300μM Pb處理時表達穩(wěn)定。60μM Pb脅迫下，隨處理時間的延長，其表達量逐步上升，處理時間為7 d時表達量最大。與Lycopersicon esculentum抗壞血酸氧化酶(ascorbateoxidase,AO)基因相似性為87﹪的PA9號克隆在寶山堇菜根中的表達量，隨Pb脅迫濃度增加和處理時間(60μM Pb脅迫下)的延長而逐步上升。但PA8和PA9號克隆片段在寶山堇菜葉中表達量對Pb脅迫響應都不