復(fù)方柴歸方抗抑郁有效組分篩選及其藥效學(xué)評價研究.pdf

1、選題依據(jù):抑郁癥是常見的情感性或心理性疾病。研究顯示:目前，中國大約有抑郁癥患者3000萬人，全球范圍內(nèi)有超過5億人正遭受著抑郁癥的折磨，其終身患病率高達20％。然而，目前治療抑郁癥的藥物不甚理想，主要以化學(xué)藥物為主，如單胺氧化酶抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑等，但這些藥物都存在治療譜窄、不良反應(yīng)大、耐受性差以及價格昂貴等問題[1～3]，而近年國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)中藥（特別是復(fù)方）治療抑郁癥在改善癥狀、降低復(fù)發(fā)率、減少西藥

2、副作用方面具有獨特效果。本課題依據(jù)臨床報道逍遙散（丸）在抑郁癥治療上顯示出的獨特效果，在前期研究基礎(chǔ)上，從逍遙散類方中篩選出逍遙散為最佳抗抑郁復(fù)方，又依逍遙散最佳抗抑郁組分的化學(xué)成分分析和藥效學(xué)篩選，得出復(fù)方柴歸方（紅柴胡、香附、青皮、甘草、生姜、薄荷），對該方抗抑郁有效組分進行系統(tǒng)而完善的工藝篩選、藥效學(xué)實驗及安全性初步評價等規(guī)范化研究工作。
　　 目的:基于中醫(yī)整體觀研究思路，從行為學(xué)和1H-NMR代謝組學(xué)兩個方面驗證復(fù)方柴

3、歸方代替逍遙散原方的可行性，并對其制備工藝、最佳給藥劑量及安全性等方面進行初步探究。
　　 方法:在前期從逍遙散類方中篩選出逍遙散為最佳抗抑郁復(fù)方的基礎(chǔ)上，進一步對其君藥基源進行篩選;依據(jù)實驗室前期篩選出逍遙散石油醚組分為最佳抗抑郁有效組分基礎(chǔ)上，并且采用HPLC-UV法、HPLC-ELSD法、GC-MS法等化學(xué)成分分析方法對逍遙散全方及單味藥材進行化學(xué)成分歸屬分析的研究結(jié)果，對去掉“白芍”和“茯苓”的“復(fù)方柴歸方”(紅柴胡30

4、 g，香附30 g，青皮30 g，甘草15g，薄荷10 g，生姜10g)石油醚組分采用小鼠懸尾實驗和小鼠強迫游泳實驗與逍遙散原方石油醚組分進行藥效學(xué)比較;在確定了復(fù)方柴歸方及其最佳比例的基礎(chǔ)上，探索了對可代替石油醚萃取的制備工藝，擬定了無毒、無污染、高效率的超臨界CO2流體萃取方法得到復(fù)方柴歸方超臨界CO2有效組分。采用小鼠懸尾實驗和小鼠強迫游泳實驗對該組分與石油醚組分進行抗抑郁藥效活性比較。運用正交實驗研究超臨界CO2最佳工藝參數(shù)條件

5、，并從產(chǎn)率以及行為學(xué)兩個指標(biāo)確定其最佳工藝參數(shù)，同時對復(fù)方柴歸方不同藥材組合提取方法得到的超臨界CO2有效組分進行抗抑郁活性篩選;在確定了復(fù)方柴歸方及其超臨界CO2最佳萃取工藝條件的基礎(chǔ)上，萃取該方有效組分，采用慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激抑郁模型(CUMS)從行為學(xué)和1H-NMR代謝組學(xué)兩個方面對該方有效組分展開藥效學(xué)評價;應(yīng)用小鼠急性毒性實驗和大鼠長期毒性預(yù)實驗對其安全性進行初步探究。
　　 結(jié)果:1.不同品種柴胡組成的逍遙散都具

6、有明顯的抗抑郁作用，但功效有所差別，即紅柴胡組成逍遙散的抗抑郁效果及起效時間略優(yōu)于北柴胡，但無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 2.通過實驗室前期對逍遙散最佳抗抑郁有效組分篩選以及進行化學(xué)成分歸屬分析后發(fā)現(xiàn)逍遙散中的“白芍”和“茯苓”兩味藥材的石油醚組分對復(fù)方石油醚組分的化學(xué)成分幾乎無貢獻的研究結(jié)果。本實驗擬去掉“白芍”和“茯苓”這兩味藥形成復(fù)方柴歸方(紅柴胡30 g，香附30 g，青皮30 g，甘草15 g，薄荷10 g，生姜10g)，對復(fù)

7、方柴歸方石油醚組分采用小鼠懸尾實驗和小鼠強迫游泳實驗與逍遙散石油醚組分進行藥效學(xué)比較。結(jié)果表明復(fù)方柴歸方石油醚組分與原逍遙散方石油醚組分抗抑郁效果相當(dāng)。
　　 3.復(fù)方柴歸方超臨界CO2有效組分與其石油醚組分進行藥效學(xué)驗證。實驗結(jié)果表明超臨界CO2有效組分與石油醚組分對于小鼠不動時間的減少沒有統(tǒng)計學(xué)差異。說明了超臨界CO2流體萃取工藝代替石油醚萃取工藝的可行性。運用正交實驗摸索了超臨界CO2萃取復(fù)方柴歸方有效組分的最佳工藝參數(shù)。

8、并對最佳提取工藝條件進行藥效學(xué)驗證，最終研究結(jié)果表明復(fù)方柴歸方超臨界CO2有效組分抗抑郁效果明確，最佳工藝參數(shù)為萃取壓力20 MPa，萃取溫度50℃，CO2流量55 kg/h，物料粒度20目，萃取時間3h，得率為2.2％。同時對復(fù)方柴歸方不同藥材組合提取方法得到的超臨界CO2有效組分進行抗抑郁活性篩選，結(jié)果表明復(fù)方柴歸全方超臨界CO2提取物抗抑郁效果最佳。
　　 4.采用慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激抑郁模型(CUMS)從行為學(xué)和1H-

9、NMR代謝組學(xué)兩個方面對復(fù)方柴歸方超臨界CO2有效組分進行藥效學(xué)評價。行為學(xué)結(jié)果表明實驗前各組大鼠的體重、糖水偏愛率及各項行為學(xué)指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)意義。在造模第21天時，空白對照組和模型組在各項指標(biāo)均具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果顯示在實驗第21天時造模成功，各給藥組中復(fù)方柴歸中劑量組對CUMS模型的干預(yù)效果最佳。
　　 尿液NMR代謝組學(xué)結(jié)果分析:采用NOESY核磁序列對大鼠尿液中的代謝物進行分析，結(jié)合單變量的統(tǒng)計學(xué)分析方法，對代謝物的主成

10、分分析得到的載荷圖中離原點遠的那些代謝物在空白對照組和模型組中的峰面積進行獨立樣本t檢驗，計算P值。只有P值小于0.05的代謝物為具有統(tǒng)計學(xué)意義的潛在生物標(biāo)志物。結(jié)果顯示，與空白對照組大鼠相比，模型組能引起大鼠尿液中醋酸、丙酮酸、琥珀酸、2-氧化戊二酸、檸檬酸、甘氨酸等含量的變化。復(fù)方柴歸中劑量組能較好地調(diào)節(jié)這些與抑郁相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。
　　 5.初步安全性評價結(jié)果表明復(fù)方柴歸方超臨界CO2有效組分毒性較低、副作用小、在一定

11、的劑量范圍內(nèi)使用安全。
　　 結(jié)論:1.復(fù)方柴歸方來源于傳統(tǒng)中藥逍遙散，由紅柴胡、香附、青皮、甘草、生姜和薄荷等組成，其中的低極性組分抗抑郁效果確切，對逍遙散原方具有可代替性。
　　 2.不同抑郁癥動物模型實驗結(jié)果均表明，采用天然、無毒、無污染的超臨界流體CO2萃取工藝制備而成的復(fù)方柴歸方有效組分的抗抑郁效果確切，且略優(yōu)于其石油醚組分。說明了超臨界CO2萃取工藝的可行性。
　　 3.復(fù)方柴歸方超臨界CO2有效組分