肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白存在于煙草懸浮系細(xì)胞核及核骨架中的證據(jù).pdf

1、BY-2型煙草葉片消毒后接種在附加0.5mg/L 2,4-D和0.5g/L酪蛋白的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)3-4次繼代后，即可得到分散性好、疏松、色澤呈鮮艷黃白色的愈傷組織；將該種愈傷組織接種在附加1mg/L 2,4-D的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，經(jīng)4-5次繼代后，即可建立起良好的煙草懸浮系。雙酶解法去除煙草懸浮系細(xì)胞的細(xì)胞壁，獲得分散均勻的原生質(zhì)體。由于技術(shù)上的問題，分離得到高純度的植物懸浮系細(xì)胞的細(xì)胞核一直是個(gè)難點(diǎn)。本研究借鑒動(dòng)

2、物細(xì)胞核的提取方法用含有0.5﹪TritonX-100的CSK緩沖液破壞煙草懸浮系細(xì)胞的細(xì)胞膜，釋放出細(xì)胞器。然后參考成株植物細(xì)胞核的提取方法采用差速離心和蔗糖-Percoll速率區(qū)帶離心法最終獲得了高純度的細(xì)胞核。向細(xì)胞核中加入PI至終濃度為50μg/ml，冰上黑暗染色，上流式細(xì)胞儀觀察分析，統(tǒng)計(jì)正常培養(yǎng)條件下煙草懸浮系細(xì)胞所處的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示正常培養(yǎng)條件下83.41﹪的細(xì)胞處于G<,0>+G<,1>期。接下去，先后用DNase

3、I消化和高鹽抽提制備細(xì)胞核骨架；同時(shí)用試劑盒提取細(xì)胞核總蛋白。以兔抗β-肌動(dòng)蛋白的抗體作一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)的羊抗兔抗體作二抗進(jìn)行免疫印跡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，煙草懸浮系細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及核骨架中均存在與β-肌動(dòng)蛋白抗體呈陽性反應(yīng)的抗原。以兔抗細(xì)胞核肌球蛋白I β的抗體作一抗，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體作二抗進(jìn)行免疫印跡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，煙草懸浮系細(xì)胞的細(xì)胞核中存在與細(xì)胞核肌球蛋白I β抗體呈陽性反應(yīng)的抗原而核骨