活細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的光學(xué)成像動(dòng)態(tài)檢測(cè).pdf

1、細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)在細(xì)胞的各種生命活動(dòng)中扮演著重要的角色。本文利用一種GFP的突變體：氧化還原敏感性GFP（reduction-oxidation-sensitive GFP，roGFP1），對(duì)順鉑（cisplatin）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中線粒體的氧化還原電勢(shì)變化動(dòng)力學(xué)過程，進(jìn)行動(dòng)態(tài)光學(xué)成像檢測(cè)，并初步探討了多光子激發(fā)對(duì)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)可能產(chǎn)生的影響，以及由多光子激發(fā)導(dǎo)致的熒光蛋白光轉(zhuǎn)換現(xiàn)象在監(jiān)測(cè)線粒體運(yùn)動(dòng)中的應(yīng)用。本研究主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和

2、結(jié)論如下：
　　 ⑴優(yōu)化基于roGFP1的細(xì)胞氧化還原比率成像條件：對(duì)Olympus FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡的成像參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并分析比較了各種參數(shù)（如PMT、pinhole等）對(duì)roGFP1在405nm和488nm雙波長激發(fā)下的熒光比率值（R405/488）的影響。研究結(jié)果證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)roGFP1蛋白質(zhì)的表達(dá)量對(duì)其R405/488值影響極小，roGFP1是一種穩(wěn)定的雙吸收波長比率型熒光探針。
　　 ⑵用熒光

3、比率成像檢測(cè)roGFP1對(duì)外源性氧化還原劑的反應(yīng)靈敏度：利用外源性氧化劑H2O2和還原劑DTT，對(duì)roGFP1的R405/488值變化動(dòng)力學(xué)過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。在我們的成像系統(tǒng)中，roGFP1能對(duì)最低0.2 mM的H2O2做出反應(yīng)；探針的R405/488值變化有很好的可逆性，即roGFP1能夠動(dòng)態(tài)可逆地反映細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。
　　 ⑶通過順鉑(cisplatin)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡，用roGFP1動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)線粒體氧化還原電勢(shì)變化

4、。結(jié)果表明，凋亡過程中，線粒體的氧化還原電勢(shì)發(fā)生了劇烈的變化；作為細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)存在某種機(jī)制能夠?qū)咕€粒體中電勢(shì)的升高（如谷胱甘肽等還原小分子）。
　　 ⑷利用roGFP1探針初步探討多光子激發(fā)是否能引起由于光致ROS增加而導(dǎo)致的線粒體的氧化還原變化。實(shí)驗(yàn)中我們卻意外發(fā)現(xiàn)多光子能引起roGFP1光譜性質(zhì)的顯著改變。利用多光子激發(fā)誘導(dǎo)的roGFP1光譜轉(zhuǎn)換特征，我們初步嘗試了用于研究線粒體的運(yùn)動(dòng)。
　　 綜上所述，