硒抑制樹突狀細胞成熟降低Th17細胞比例治療自身免疫甲狀腺炎的研究.pdf

1、Th22細胞是近年來新鑒定出的CD4+T細胞亞群，與Th17、Th1或Th2細胞不同的是，這種細胞在分泌IL-22的同時而不分泌IL-17、IFN-γ或IL-4，同時有著獨自的細胞分化途徑。許多研究表明Th22細胞在多種自身免疫病的發(fā)病機制中扮演著重要的作用。目前，關于自身免疫甲狀腺病(AITD)的Th22細胞研究十分有限，本研究將研究Th22細胞在AITD中的作用。
　　方法:
　　本研究共入選了59例AITD患者，所有患

2、者均來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內分泌門診。這包括23例橋本氏甲狀腺炎患者(HT)和36例Graves病(GD)患者，其中GD患者包括24例未治療的GD(uGD)患者，12例經(jīng)過治療甲功正常的GD(eGD)患者，另外還有21例健康自愿者(Control)。
　　采取空腹靜脈血，3ml抗凝靜脈血和3ml促凝靜脈血，所有入選的人均檢測了血清FT4、FT3、TSH、TPOAb及TGAb。無菌操作，使用梯度離心法從抗凝血中分離出外周血單個

3、核細胞(PBMC)。然后，我們使用流式細胞術(FACS)檢測了PBMCs中的Th22細胞、Th17細胞、Th2細胞及Th1細胞的比例，同時分析了HT患者中Th22細胞和Th17細胞的關系。另外，我們也分離出3ml促凝靜脈血中的血清，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測了所有人血清中IL-22、IL-17、IL-4及IFN-γ的含量。
　　我們在每組中各選取了部分患者，取血5ml為抗凝靜脈血，利用其中的PBMCs進行了體外實驗。在

4、Th22細胞體外極化條件下，將PBMCs體外培養(yǎng)6天，然后使用FACS檢測CD3+CD8-IL-22+細胞的比例，并使用ELISA方法檢測了上清液中IL-22的含量。
　　結果:
　　HT患者外周血Th22細胞比例（2.01±1.09％）比uGD組(0.78±0.48％，P＜0.001)，eGD組（0.67±0.46％，P＜0.001），和control組（0.71％±0.42％，P＜0.001）都有顯著增高。并且HT組患者

5、血清IL-22水平與Th22細胞比例顯著相關，且較其它組血清IL-22水平均升高。
　　HT組者外周血Th17細胞比例（3.17±1.31％）比uGD組(1.98±1.01％，P＜0.001),eGD組（1.53±0.62％,P＜0.001），和control組（1.69±0.63％,P＜0.001)也均顯著增高。但各組中血清IL-17水平無顯著差異。
　　在HT患者組中，分泌IL-22的Th17細胞占Th17細胞很大的比例

6、，同時我們發(fā)現(xiàn)在HT患者中，外周血Th17細胞比例與Th22細胞比例成顯著正相關(R2=0.5711，P＜0.001)，同時血清IL-22水平與Th17細胞成顯著正相關(R2=0.3188, P=0.005)。
　　HT組患者和uGD組患者外周血Th1水平均較對照組輕度升高。同時uGD患者外周血Th2細胞比例較eGD組或control組人群均有顯著升高。
　　體外培養(yǎng)PBMCs，在Th22細胞極化條件下，可以培養(yǎng)出更高比例的

7、Th22細胞，同時來源于HT患者的PBMCs極化出的Th22細胞比例要高于其它組，上清液中IL-22水平也顯著增高。
　　結論:
　　本研究提示Th22細胞及Th17細胞在HT疾病中扮演了重要的作用。同時GD的發(fā)病可能與Th2細胞有關，而與Th22細胞或Th17細胞無明顯相關。
　　近年來的臨床研究發(fā)現(xiàn)硒干預可以治療自身免疫甲狀腺炎(AIT)，降低其外周血甲狀腺自身抗體水平，但是硒治療的免疫機制沒有被闡明。目前認為在炎

8、癥反應的抗原遞呈過程中，活性氧的升高扮演著重要的作用，而抗氧化劑可能通過抑制抗原遞呈細胞(APC)的激活而抑制炎癥反應。本研究將建立硒治療AIT的體內及體外實驗，首次從硒通過降低活性氧(ROS)水平降低抗原遞呈過程的角度去探討其治療自身免疫甲狀腺炎的免疫機制，并且將確定硒通過降低ROS作用于抗原遞呈過程的具體分子機制。
　　方法:
　　首先我們通過硒干預高碘誘發(fā)的自身免疫甲狀腺炎AIT小鼠模型進行了體內實驗。5-6周齡NOD

9、.H-2h4小鼠被隨機分為四組:對照組、AIT組（含0.05％NaI飲水喂養(yǎng)）、Se1組（含0.05％NaI飲水喂養(yǎng)同時1 mg/kg含硒飼料喂養(yǎng)）、Se2.5組（含0.05％NaI飲水喂養(yǎng)同時2.5 mg/kg含硒飼料喂養(yǎng)）。干預12周后觀察干預效果及機制。1、測定甲狀腺濕重，并使用HE染色檢測甲狀腺組織淋巴細胞浸潤。2、使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清TGAb水平。3、分離脾臟中單個核細胞(PBMC)，檢測其中CD11c+

10、樹突狀細胞表面CD40、CD80、CD86及MHCⅡ表達水平，同時檢測其中Th17及Th1細胞比例。
　　而后我們以健康自愿者及橋本氏甲狀腺炎(HT)患者為研究對象，進行體外實驗。由單核細胞體外培養(yǎng)獲得樹突狀細胞(Mo-DC)，在Mo-DC成熟的過程中，給予不同濃度(3，6，10，20)μM亞硒酸鈉或抗氧化劑(2mM) N-乙?；?L-半胱氨酸NAC干預，觀察Mo-DC表面CD40、CD80、CD86及HLA-DR表達，并通過檢測

11、Mo-DC胞內ROS水平和NF-κB激活，研究其成熟過程中ROS的作用及亞硒酸鈉體外干預效果及分子機制。其中細胞內ROS水平使用活性熒光染料CM-H2DCFDA測定，并檢測NF-κB的激活。最后進行混合淋巴細胞反應(MLR)。在異體MLR中，檢測不同濃度亞硒酸鈉或NAC干預后的Mo-DC刺激CD4+T細胞增殖的能力。在自體MLR中，檢測不同濃度亞硒酸鈉或NAC干預后的樹突狀細胞刺激CD4+T細胞分泌IL-6和IL-17的水平。
　

12、　結果:
　　在體內試驗中，我們觀察到了高劑量硒干預組可以顯著減輕甲狀腺局部淋巴細胞浸潤，并且降低血清TGAb水平。AIT組小鼠外周脾臟CD11c+樹突狀細胞表面CD40、CD80、CD86及MHCⅡ水平較Control組顯著增高，AIT組小鼠外周脾臟Th17細胞比例較Control組顯著增高，而Se2.5組CD11c+樹突狀細胞表面CD80及CD86水平較AIT組有降低，而Se2.5組Th17細胞比例較AIT組有降低。
　

13、　在體外實驗中，觀察到Mo-DC的成熟過程中胞內ROS水平上調，P-p65水平增高。而(3，6，10，20)μM亞硒酸鈉或2mM NAC干預可以抑制其成熟過程中ROS水平提高，并且抑制其下游NF-κB的激活，并且抑制了Mo-DC表面CD40、CD80、CD86及HLA-DR的表達，并且抑制程度與硒干預濃度成正比。在異體MLR中，10μM亞硒酸鈉或2mM NAC干預后的Mo-DC刺激CD4+T細胞增殖的能力減弱。在自體MLR中，10μM亞