甜菊糖苷代謝轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究.pdf

1、甜菊糖苷，一種貝殼杉烯型四環(huán)二萜類化合物，是天然甜味劑甜菊糖的主要成分之一，已被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥等行業(yè)。早期研究表明，甜菊糖不但具有高甜低熱的特性，同時(shí)還具有多種藥理活性，如抗高血壓、抗糖尿病、抗齟齒等。本文以甜菊糖主要成分萊鮑迪苷A(RA)、甜菊醇（SV)及其體內(nèi)主要代謝物葡糖醛酸結(jié)合物（SVG)為研究對(duì)象，利用微粒體、重組酶、細(xì)胞、動(dòng)物等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑥捏w外、體內(nèi)兩方面闡明其代謝轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，同時(shí)基于代謝轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制考察甜菊糖與藥物合

2、用時(shí)可能產(chǎn)生的潛在相互作用，為其安全合理應(yīng)用提供依據(jù)。
　　本研究首先建立了快速、靈敏的LC-MS/MS方法用于檢測樣品中SVG的含量。樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白處理后，使用C18色譜柱（2.3x50mm，5pm)進(jìn)行液相分離，在負(fù)離子MRM模式下檢測SVG。線性范圍為2?1000 nM，方法具有良好的重現(xiàn)性。為闡明SV在體內(nèi)的代謝清除機(jī)制，我們利用肝微粒體和腸微粒體對(duì)SV的內(nèi)在清除率進(jìn)行了考察。首先，對(duì)蛋白濃度和孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，蛋

3、白濃度0.2 mg/ml和反應(yīng)時(shí)間5 min最佳。在人、鼠肝微粒體和腸微粒體四種代謝體系中，SV均能快速發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)生成SVG,且呈現(xiàn)明顯的底物抑制現(xiàn)象。在人和大鼠中，SVG的生成速率相似，但肝微粒體中SVG生成速率顯著高于腸微粒體，提示肝是SV發(fā)生葡萄糖醛酸化反應(yīng)的主要器官。為進(jìn)一步闡明SVG在體內(nèi)的生成機(jī)制，本研究利用12種FDA規(guī)定的重組人UGT酶亞型進(jìn)行底物篩查。結(jié)果表明，在苷元濃度為2hM時(shí)，UGT2B7可介導(dǎo)SV快

4、速發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)，催化生成SVG;當(dāng)苷元濃度升到20nM時(shí)，UGT2B7和UGT1A3均可顯著介導(dǎo)SVG的生成。隨后在兩種重組酶中的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，與微粒體類似，在重組酶中同樣出現(xiàn)了明顯的底物抑制現(xiàn)象。提示UGT2B7是介導(dǎo)人體內(nèi)SV發(fā)生葡萄糖醛酸化的主要二相代謝酶?？疾炝巳梭w主要外排轉(zhuǎn)運(yùn)體和攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體是否參與SVG的處置過程。我們首先利用穩(wěn)定表達(dá)hMDRl、hBCRP、hMRP2或hMATEl的MDCKII細(xì)胞進(jìn)行

5、雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，這些外排轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)SVG的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)無明顯作用。隨后，我們利用穩(wěn)定表達(dá)攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體hOATl、hOAT3、hOCT2、hOATPlA2、hOATPlBl、hOATPlB3或hOATP2Bl的HEK293細(xì)胞系進(jìn)行考察。結(jié)果表明，hOAT3及hOATPs對(duì)S V G的細(xì)胞攝取起重要作用，且h O A T3對(duì)S V G的排泄作用遠(yuǎn)高于hOATPs，提示hOAT3是介導(dǎo)SVG體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)清除的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體。為了進(jìn)一步研究是否存在S

6、V與藥物的相互作用，我們對(duì)SV與藥物或天然小分子化合物之間的相互作用進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UGT2B7的底物齊多夫定、氟哌啶醇、雙氯芬酸對(duì)SVG生成均有不同程度的抑制作用，其中以雙氯芬酸的抑制作用最強(qiáng)，Ki為4.2pM,屬于競爭性抑制。并且，SV可反作用于雙氯芬酸，抑制其代謝清除。提示S V與雙氯芬酸之間可能存在UGT2B7介導(dǎo)的相互作用。基于轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的相互作用研究發(fā)現(xiàn)，多種藥物和天然小分子化合物可顯著抑制SVG的細(xì)胞攝取，尤其是hO

7、AT3及hOATPlB3介導(dǎo)的細(xì)胞攝取。其中，抑制作用最強(qiáng)的是槲皮素、替米沙坦、雙氯芬酸和桑皮黃素，對(duì)hOAT3的攝取抑制作用IC5Q值分別為1.82^M、2.92|xM、8.01\iM和9.97\iMo。在大鼠原代肝細(xì)胞中的研究表明，SVG可顯著被原代肝細(xì)胞攝取，替米沙坦及桑皮黃素可顯著抑制這一過程，且具有明顯的濃度依賴性，IC5。值分別為2.0 pM和7.1 mM。大鼠體內(nèi)相互作用研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)灌胃給予大鼠RA(15 mg/kg)和