氯化錳致谷氨酸代謝轉(zhuǎn)運(yùn)障礙和利魯唑的防護(hù)作用及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、前言
　　 錳(manganese,Mn)作為機(jī)體的必需微量元素之一,在體內(nèi)可參與許多生物化學(xué)反應(yīng)。但是,過量的錳進(jìn)入體內(nèi)則會引起錳中毒,出現(xiàn)類似帕金森氏綜合征的神經(jīng)系統(tǒng)病變。人類可以通過職業(yè)吸入和環(huán)境暴露等途徑接觸神經(jīng)毒物--錳。進(jìn)入體內(nèi)的錳主要蓄積在大腦的紋狀體和蒼白球等基底神經(jīng)節(jié)部位。進(jìn)入腦組織中的錳主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取,并存儲于其中。
　　 目前,對于錳中毒致神經(jīng)損傷機(jī)制的研究多局限于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。近年來,有

2、學(xué)者提出,錳中毒可導(dǎo)致興奮性遞質(zhì)谷氨酸(glutamate,Glu)釋放加劇,對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,但其機(jī)制尚未被完全闡明。而Glu的清除主要依賴于谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate transporters,GluTs)對其重?cái)z取,以終止其突觸傳遞效應(yīng)?，F(xiàn)已經(jīng)通過克隆技術(shù)獲得五種不同的GluTs,其中谷氨酸/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate/aspartate transporter,GLAST)和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glutamat

3、e transporter-1.GLT-1)主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上。攝入到胞內(nèi)的Glu可在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)的作用下轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺(glutamine,Gln),Gln再回轉(zhuǎn)至神經(jīng)元,并在磷酸激活的谷氨酰胺酶(phosphate activated glutaminase,PAG)作用下重新生成Glu,形成Glu-Gln循環(huán)。故推測Glu的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)障礙可能會在錳中毒的發(fā)生、發(fā)展中起著重

4、要的作用。
　　 利魯嘩是一種Glu調(diào)節(jié)劑,具有阻斷Na+離子通道的作用,在臨床上用于治療肌萎縮性側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)。已有文獻(xiàn)證實(shí)利魯唑具有抑制Glu釋放,促進(jìn)Glu攝取,增強(qiáng)Glu與GluTs結(jié)合的作用。但是,目前應(yīng)用利魯唑干預(yù)錳中毒致Glu代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的研究,鮮有報(bào)道。
　　 本研究擬通過體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法,首先建立動物模型,研究MnCl2致大鼠

5、腦紋狀體Glu代謝轉(zhuǎn)運(yùn)障礙及利魯唑的防護(hù)作用。其次,建立細(xì)胞培養(yǎng)模型,研究MnCl2致星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性及利魯唑的防護(hù)作用。最后,對星形膠質(zhì)細(xì)胞Glu代謝轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行研究,探討MnCl2產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用的機(jī)制,及利魯唑的防護(hù)作用,并進(jìn)一步驗(yàn)證體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
　　 材料與方法
　　 1、MnCl2致大鼠腦紋狀體Glu代謝轉(zhuǎn)運(yùn)障礙及利魯唑的防護(hù)作用
　　 由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供實(shí)驗(yàn)用清潔級Wistar大鼠100只

6、,體重180±10克,雌雄各半。按體重隨機(jī)分成5組,每組20只。第1組為對照組,第2～4組分別為低、中、高劑量染錳組,第5組為利魯唑干預(yù)組。第1～4組均皮下注射生理鹽水,第5組皮下注射21.35μmol/kg利魯唑。2小時(shí)后,第1組腹腔注射生理鹽水,第2、3組分別腹腔注射8和40μmol/kg MnCl2,第4、5組均腹腔注射200μmol/kg MnCl2,注射容量均為5ml/kg。連續(xù)染毒4周,每周5次,隔日干預(yù)1次。最后一次干預(yù)并

7、染毒24小時(shí)后,每組取8只大鼠乙醚麻醉后,處死,取其部分紋狀體,使用火焰原子吸收法測定組織中錳的含量。然后,每組取2只大鼠,使用4％多聚甲醛灌流后取紋狀體,部分組織用HE染色觀察組織病理形態(tài)改變,另取部分組織,用2.5％戊二醛固定,應(yīng)用透射電鏡觀察其內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。再取各組4只大鼠,分離紋狀體后,制備成單細(xì)胞懸液,用流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM)檢測細(xì)胞凋亡的情況。各組再取6只大鼠,使用試劑盒測定組織中Gl

8、u和Gln的含量,依據(jù)Renis等描述的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的非生理學(xué)催化反應(yīng)測定GS的活力,依據(jù)Curi等的方法測定PAG的活力,應(yīng)用Murali等的方法測定Na+-K+-ATPase的活力。再取上述用于Mn含量測定的4只大鼠剩余紋狀體用RT-PCR法檢測GS、GLAST及GLT-1 mRNA表達(dá),另外4只大鼠剩余紋狀體用于Western blot法檢測GS、GLAST及GLT-1蛋白水平。
　　 2、MnCl2致星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性

9、及利魯唑的防護(hù)作用
　　 參照Hertz等的方法進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),應(yīng)用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein,GFAP)免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞鑒定,陽性率達(dá)95％后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過MTT法和LDH漏出分析法,觀察MnCl2(0～1000 μmol/L)處理6～48h后細(xì)胞毒性的變化和利魯唑(25～200 μmol/L)預(yù)處理1～12h后的干預(yù)作用,并選擇適宜且有代表性的錳處理和利魯唑

10、干預(yù)的劑量和時(shí)間。然后,使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,應(yīng)用FCM檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。
　　 3、MnCl2致星形膠質(zhì)細(xì)胞Glu代謝轉(zhuǎn)運(yùn)障礙及利魯唑的防護(hù)作用
　　 星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)終濃度為0、125、250和500μmol/t,MnCl2處理24h后,并在500μmol/L MnCl2的劑量水平上提前6小時(shí)給予100μmol/L 利魯唑干預(yù)。參照上述方法檢測GS和Na+-K+-ATPase的活力,GS、

11、GLAST及GLT-1 mRNA表達(dá)和蛋白水平。
　　 4、數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析
　　 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS 11.5軟件單因素方差分析方法(ANOVA)進(jìn)行組間差異的顯著性檢驗(yàn),兩組間比較用q檢驗(yàn)(Student-Newman-Keuls,SNK)。
　　 結(jié)果
　　 1、MnCl2致大鼠腦紋狀體Glu代謝轉(zhuǎn)運(yùn)障礙及利魯唑的防護(hù)作用
　　 與對照組相比,隨著錳處理劑量的增加

12、,大鼠紋狀體組織內(nèi)Mn含量逐漸增加,紋狀體組織形態(tài)及其內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)損傷的程度逐漸加重；紋狀體細(xì)胞凋亡率逐漸增加；Glu含量逐漸增加,Gln含量逐漸降低；PAG活力逐漸增加,GS和Na+-K+-ATPase的活力逐漸下降；GS、GLAST及GLT-1 mRNA表達(dá)和蛋白水平逐漸降低。與200μmol/kg MnCl2組相比,在利魯唑干預(yù)組中,Mn含量降低,紋狀體組織形態(tài)及其內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷的程度緩解；紋狀體細(xì)胞凋亡率下降；G

13、lu含量降低,Gln含量增高；PAG活力下降,GS和Na+-K+-ATPase的活力上升；GS、GLAST及GLT-1的mRNA表達(dá)和蛋白水平增高。
　　 2、MnCl2致星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性及利魯唑的防護(hù)作用
　　 培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定后,陽性率95％。通過MTT法和LDH漏出分析法觀察MnCl2對星形膠質(zhì)細(xì)胞是否具有細(xì)胞毒性作用。結(jié)果表明,隨著錳處理劑量(0～1000μmol/L)和時(shí)間(6

14、～48h)的增加,星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力逐漸下降,LDH漏出逐漸增加,并呈現(xiàn)出一定的劑量和時(shí)間依賴性的效應(yīng)關(guān)系。且在500μmol/L MnCl2的劑量水平上,處理24小時(shí)后,細(xì)胞活性率達(dá)51.81％,大約達(dá)到半數(shù)抑制濃度(50％inhibitory concentration,IC50)。提前1h、3h、6h和12h給予星形膠質(zhì)細(xì)胞25～200μmol/L利魯唑干預(yù)后。使用MTT法和LDH漏出分析法觀察發(fā)現(xiàn),與500μmol/L MnCl

15、2組比較,在100和200μmol/L 利魯唑干預(yù)6h和12h后,星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力明顯增加,LDH漏出明顯下降。但在同一時(shí)間水平,在100和200μmol/L利魯唑兩個(gè)劑量組之間并未見顯著差異,且在同一劑量水平,6h和12h兩個(gè)時(shí)間組之間亦未見顯著差異。故在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,我們選擇0、125、250和500μmol/L MnCl2和24h分別作為錳處理的劑量和時(shí)間,100μmol/L利魯唑和6h分別作為干預(yù)劑量和時(shí)間。與對照組相比,隨著

16、錳處理劑量的增加,星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)損傷程度逐漸加劇；星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率逐漸增加；G0/G1期細(xì)胞指數(shù)逐漸升高,S期細(xì)胞指數(shù)逐漸降低,G2/M期細(xì)胞指數(shù)未見明顯差異。與500μmol/L MnCl2組相比,在利魯唑提前干預(yù)6h組中,星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)損傷明顯降低;星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率顯著下降；G0/G1期細(xì)胞指數(shù)顯著下降,S期細(xì)胞指數(shù)顯著增加,G2期細(xì)胞指數(shù)未見明顯改變。
　　 3、MnCl2致星形膠質(zhì)細(xì)胞Glu代謝轉(zhuǎn)運(yùn)障礙及

17、利魯唑的防護(hù)作用
　　 0、125、250和500μmol/L MnCl2處理24h后,與對照組相比,隨著錳處理劑量的增加,GS和Na+-K+-ATPase的活力逐漸下降,GS、GLAST及GLT-1 mRNA表達(dá)和蛋白水平亦逐漸降低。與500μmol/L MnCl2組相比,在100μmol/L利魯唑干預(yù)組中,GS和Na+-K+-ATPase的活力明顯增加,GS、GLAST及GLT-1 mRNA表達(dá)和蛋白水平也均顯著增加。