電致化學發(fā)光生化新體系及其分析策略研究.pdf

1、電致化學發(fā)光（Electrochemiluminescence,ECL）以電化學為基礎，通過電極表面電化學反應導致的化學發(fā)光現象進行特定物質的定量分析檢測，其同時結合了電化學的高可控性和化學發(fā)光法的超靈敏性，極大地提高了分析檢測方法的性能，并賦予了其獨特的優(yōu)勢，諸如靈敏度高、線性范圍寬、操作簡單、可控性強、分析快速簡便等。近年來，伴隨著納米技術及生物技術的快速發(fā)展，電致化學發(fā)光技術更是取得了蓬勃的發(fā)展進步，作為一種高效、靈敏的分析檢測技

2、術，在生命分析、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等領域備受關注。目前，電致化學發(fā)光材料正朝著高效、綠色、多功能的方向發(fā)展；而電致化學發(fā)光分析技術亦正朝著高靈敏、高通量、普適等方向發(fā)展。然而，針對一些特殊研究體系，現有電致化學發(fā)光體系尚存在靈敏度不足、檢測過程復雜繁瑣、適用性不強等方面的缺陷?；诖?，本論文主要從電致化學發(fā)光檢測體系的靈敏度、高通量、適用性等方面出發(fā)，通過高效自增強電致化學發(fā)光技術、原位酶促反應增強、核酸擴增放大及高效電致化學發(fā)光材料等

3、方法提高電致化學發(fā)光技術的分析檢測靈敏度；通過多元分析、競爭反應等策略提高電致化學發(fā)光技術的適用性。在此基礎上，實現了多種疾病標志物及細胞功能檢測研究。本論文的研究工作主要分為以下幾個部分：
　　1.基于自增強復合納米材料的超靈敏細胞傳感器構建及其在藥物篩選中的應用研究
　　抗癌藥物研究具有極其重要的科學意義及社會價值，尤其是高效、低廉、特異、甚至個體化的抗癌藥物?；诩毎蛲龇治龅乃幬锖Y選評價系統(tǒng)亟需更為靈敏、準確、有效、

4、便捷的分析檢測技術。靈敏度高、反應可控性好、便捷低廉的電致化學發(fā)光技術具有極大的潛在應用價值，然而電致化學發(fā)光材料及共反應劑等的生物毒性、分析檢測方法靈敏度等方面尚需進一步改善。本研究提出了一種自增強電致化學發(fā)光納米材料的制備方案。通過羧基化聯吡啶釕與氨基側鏈修飾的甲氧基硅烷偶聯，制得功能化的二氧化硅納米材料前體，其中聯吡啶釕作為電致化學發(fā)光中心，氨基側鏈作為共反應試劑。在此基礎上，通過堿性條件下水解作用，成功制得自增強電致化學發(fā)光納米

5、材料，并成功將其應用于基于細胞凋亡分析的抗腫瘤藥效評價系統(tǒng)的構建，實現了高效、快速、便捷的抗腫瘤藥效評價。實驗研究同時采用乳腺癌腫瘤細胞（MDA-MB-231）和抗腫瘤藥物（紫杉醇）作為模型研究了所構建的抗腫瘤藥效評價系統(tǒng)的適用性，取得了較好的分析效果。該工作提出了自增強電致化學發(fā)光納米材料的設計構建方式，并對其自增強機理進行了相應的研究；同時，實現了電致化學發(fā)光分析技術在亟需的藥物篩選評價系統(tǒng)中的應用，進一步拓展了電致化學發(fā)光分析技術

6、的研究應用，為進一步的電致化學發(fā)光技術及藥物篩選評價等提供參考借鑒。
　　2.基于多元分析的多組份電致化學發(fā)光分析策略研究
　　電致化學發(fā)光分析技術由于其低背景、高靈敏度、寬線性范圍、低耗用等突出優(yōu)點而倍受關注。然而，截至到目前為止，絕大多數的電致化學發(fā)光分析僅僅能在同一界面上實現單一目標物的定量分析。而臨床檢測、環(huán)境分析、食品安全等方面迫切需求一種更為高效、靈敏的多組份電致化學發(fā)光分析檢測技術。本研究設計了一種基于多元分析

7、的多組份電致化學發(fā)光分析策略，結合以雜交連鎖反應-滾環(huán)擴增反應為基礎的級聯放大策略，構建一種高靈敏的多組份電致化學發(fā)光分析系統(tǒng)。采用心肌損傷類標志物，N末端B型利鈉肽原和肌鈣蛋白I為檢測模型，分別以魯米諾和聯吡啶釕為信號探針，研究討論了該方法的分析檢測性能。其中，通過多元分析有效地解決了不同電致化學發(fā)光信號探針間相互影響的關鍵問題；采用HCR-RCA為基礎的級聯放大策略有效地提高了檢測靈敏度，實現了同一界面多組份的高靈敏分析檢測，為進一

8、步構建高通量的電致化學發(fā)光檢測系統(tǒng)奠定了良好的基礎。
　　3.基于競爭法的電致化學發(fā)光免疫傳感技術用于單一界面多目標物比率分析的研究
　　現今，采用抗腫瘤藥物來消滅腫瘤細胞仍作為抗擊腫瘤的一種重要手段而備受關注。然而，由于長時間使用藥物等易導致腫瘤細胞耐藥而出現療效差，甚至無療效的情況。若能在腫瘤細胞耐藥早期，通過調整治療方案，則可以有效地避免或減少細胞耐藥，然而尚缺乏高效、高靈敏、準確的早期細胞耐藥偵檢系統(tǒng)。電致化學發(fā)光分

9、析作為一種高效、靈敏的潛在可用分析技術而備受關注。通常細胞耐藥性可以通過P糖蛋白表達情況來確定，而對于P糖蛋白表達分析而言，不僅僅需要對P糖蛋白的高靈敏定量分析，同時需要輔助以細胞計數或者輔助以另外一種恒定表達蛋白的高靈敏定量分析作為對照，通過計算 P糖蛋白與恒定表達蛋白的濃度比值來實現P糖蛋白的表達分析。雖然采用如前所述的基于多元分析的多組份電致化學發(fā)光分析策略可以實現了同一界面上多種目標物的同時檢測。但是，多元分析仍比較耗時，亟需更

10、為便捷有效的檢測方式實現細胞耐藥分析。值得注意的是，通過蛋白質表達來評估細胞耐藥程度，僅僅需要耐藥相關蛋白與恒定表達蛋白的濃度比值即可，而不需要兩者的準確濃度。本研究通過基于免疫識別的目標物轉換結合滾環(huán)擴增信號放大策略和電致化學發(fā)光傳感器表面修飾核酸的競爭反應構建了一種用于比率分析的高靈敏電致化學發(fā)光分析策略，以P糖蛋白和甘油醛-3-磷酸脫氫酶為檢測模型評估腫瘤細胞耐藥程度。首先，磁珠表面的免疫識別反應，以夾心法檢測模式，通過固定于磁珠

11、表面生物素化抗體分別特異性識別P糖蛋白和甘油醛-3-磷酸脫氫酶，并進一步結合核酸標記二抗，實現目標物轉化；為了提高分析檢測靈敏度，采用滾環(huán)擴增放大策略，以標記于抗體上的核酸為引發(fā)鏈，延伸得到以滾環(huán)為模板的重復序列，并經DSN酶剪切實現1﹕N目標物擴增放大；剪切獲得的重復序列部分一致，能夠與電極表面的捕獲序列形成競爭反應，并進一步結合電致化學發(fā)光材料，聯吡啶釕標記信號探針，通過電致化學發(fā)光信號指示競爭反應結果，進而實現P糖蛋白和甘油醛-3

12、-磷酸脫氫酶的比率檢測，實現對細胞耐藥程度的評估。該比率分析策略亦可推廣于電化學、熒光、化學發(fā)光法等對于多種目標物，諸如蛋白、核酸等的高效、便捷、高靈敏的比率分析測定，同時提供了一種有效策略用于生化分析、臨床診斷，尤其是細胞功能測定等。
　　4.基于時間調控的檢測范圍可調式電致化學發(fā)光技術研究
　　近年來，高靈敏電致化學發(fā)光分析技術更是得到了長足的發(fā)展進步。然而，截至目前為止，絕大多數的電致化學發(fā)光分析技術由于修飾界面單一，

13、僅僅能夠實現固定靈敏度及固定檢測范圍內的目標物分析。由于同一檢測目標物在不同樣本中的濃度差異懸殊，通常電致化學發(fā)光分析技術難于直接應用于樣本分析檢測，而繁瑣的分離富集/稀釋等操作成為定量分析的隱性必需內容之一，這無疑增加了分析檢測工作量，并在一定程度上降低了分析檢測的準確性。以Pb2+離子的分析檢測作為模型，本研究通過在電極表面的核酸特異性雜交，層層組裝核酸網狀結構，并于網狀結構內部設計DNA酶，且于網狀結構的雙鏈內鑲嵌電致化學發(fā)光材料

14、構建針對Pb2+離子的可調式電致化學發(fā)光傳感器。由Pb2+離子介導的DNA酶循環(huán)剪切所組裝的核酸網狀結構，同時釋放電致化學發(fā)光材料，導致電致化學發(fā)光信號降低，以此實現對Pb2+離子的定量分析。而剪切效率不僅與Pb2+離子濃度相關，同時與反應時間相關，由此通過控制反應時間以調節(jié)檢測線性范圍、檢測靈敏度等。實驗研究所構建的可調式電致化學發(fā)光策略亦可推廣適用于其他諸如蛋白、核酸等的靈敏可調式檢測，為環(huán)境安全及臨床檢驗提供一種新型的分析策略。<

15、br>　　5.基于銥配合物納米材料及原位酶放大的電致化學發(fā)光傳感器研究
　　三苯基吡啶銥配合物作為一種高量子轉化效率、高電子轉移效率的優(yōu)良電致化學發(fā)光材料，有望以此為基礎構建更高檢測靈敏度的電致化學發(fā)光技術。然而其水溶性差、難于標記等缺陷限制了其在電致化學發(fā)光傳感技術領域的廣泛應用。本研究采用三苯基吡啶銥配合物摻雜二氧化硅納米材料實現了電致化學發(fā)光材料的高效固載，并極大程度地改善了其水溶性。實驗研究以心衰標志物，N末端B型利鈉肽原

16、作為研究模型，探究了基于銥配合物納米材料及原位酶放大的電致化學發(fā)光傳感器的性能。電致化學發(fā)光傳感器采用Nafion分散三苯基吡啶銥配合物摻雜二氧化硅納米材料包覆于電極表面，并進一步偶聯固定抗N末端B型利鈉肽原抗體來構建。基于此，所制備的電致化學發(fā)光傳感器具有較強的電致化學發(fā)光信號。當檢測樣本中含有N末端B型利鈉肽原時，其能夠通過特異性免疫識別結合于電極表面，并進一步結合葡萄糖氧化酶標記的二抗。通過葡萄糖氧化酶催化葡萄糖產生過氧化氫對電致