化香樹(shù)果序醇提物誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生methuosis死亡的機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　鼻咽癌起源于人鼻咽部粘膜上皮和腺體的惡性腫瘤，發(fā)病人群主要分布于中國(guó)華南地區(qū)，廣東省人數(shù)尤其較多，因此又稱(chēng)為“廣東癌”。目前，鼻咽癌的臨床治療主要以放療、化療為主，但這兩種方法副作用較大且有約30％的患者即使運(yùn)用這兩種方法進(jìn)行綜合治療，5年生存率仍較低。
　　近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多種中藥具有抗腫瘤作用，且以放化療為主、中藥為輔的綜合治療方案能在一定程度上提高腫瘤患者的5年生存率。因此，中藥被認(rèn)為是一種治療腫瘤的有效輔

2、助藥物?；銟?shù)果序是一種主要產(chǎn)于華南和西南各省的中藥材。既往研究表明，其水煎物對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE2具有細(xì)胞毒性作用，但具體藥理機(jī)制尚未闡明。
　　Methuosis死亡的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，目前部分研究認(rèn)為methuosis死亡是macropinocytosis過(guò)程出現(xiàn)異常時(shí)發(fā)生的一種細(xì)胞死亡方式。在藥物和外界刺激下，macropinosomes會(huì)在細(xì)胞內(nèi)大量積累，彼此相互融合逐步形成更大的液泡，同時(shí)細(xì)胞核不會(huì)發(fā)生明顯改變，隨

3、后細(xì)胞代謝活動(dòng)會(huì)逐漸減少，細(xì)胞膜發(fā)生破裂，最終細(xì)胞死亡。Methuosis細(xì)胞死亡方式的發(fā)現(xiàn)可為對(duì)抗凋亡藥物耐藥的惡性腫瘤患者提供新的治療途徑。
　　此前，課題組通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，化香樹(shù)果序醇提物(Alcohol extract of Platycarya strobilacea sieb.et Zucc，PSZ)能抑制CNE1和CNE2增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生methuosis死亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)methuosis死亡

4、發(fā)生的具體機(jī)制仍未有明確的闡述。本研究旨在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究化香樹(shù)果序醇提物誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生methuosis死亡的相關(guān)信號(hào)通路，并初步篩選methuosis死亡發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為中藥治療惡性腫瘤提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　目的:
　　研究化香樹(shù)果序醇提物誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生methuosis細(xì)胞死亡的范圍及methuosis死亡發(fā)生的相關(guān)信號(hào)通路，同時(shí)初步篩選導(dǎo)致該死亡方式發(fā)生的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
　　方法:

5、>　　第1部 分化香樹(shù)果序生藥材的提取工藝及其主要成分分析
　　用乙醇回流方法提取化香樹(shù)果序生藥材，隨后濃縮、干燥藥物，利用高效液相色譜技術(shù)(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析醇提物的主要成分。
　　第2部分 檢測(cè)化香樹(shù)果序醇提物對(duì)不同病理類(lèi)型人鼻咽癌細(xì)胞的作用效果
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SUNE1、CNE1、CNE2和5-8F細(xì)胞分別接種于6孔培養(yǎng)板（1.2×10

6、5cells/ml，2ml/孔），細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24h后分別進(jìn)行相應(yīng)處理，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞在4h、8h、12h、24h、48h這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)學(xué)改變。
　　第3部分 化香樹(shù)果序醇提物誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生methuosis死亡的機(jī)制研究
　　3.1 生物信息學(xué)分析
　　在本課題組前期全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)篩選與methuosis死亡相關(guān)的信號(hào)通路。
　　3.2 熒光實(shí)時(shí)定量PC

7、R(Real-time qPCR)檢測(cè)各組相關(guān)基因的表達(dá)水平
　　化香樹(shù)果序醇提物(1.0mg/m)干預(yù)24h后，分別提取各組RNA，逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增，RT-qPCR比較H-Ras、Arf6、Rac1、MAPK1、MAPK3和FOS六個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)差異。
　　3.3 Western Blot檢測(cè)H-Ras和Rac1蛋白的表達(dá)水平
　　化香樹(shù)果序醇提物（1.0mg/m）干預(yù)24h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，Bicinchoni

8、nic acid(BCA)法蛋白定量檢測(cè)，Westem Blotting(WB)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)H-Ras和Rac1蛋白的表達(dá)水平。
　　3.4 Rac1抑制劑EHT1864干預(yù)實(shí)驗(yàn)
　　將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE1和CNE2細(xì)胞分別接種于6孔培養(yǎng)板(1.2×105cells/ml，2ml/孔)，細(xì)胞箱孵育24h后分別進(jìn)行相關(guān)藥物處理，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞在4h、8h、12h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)學(xué)改變。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分

9、析:
　　本課題組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS Statistics20.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s）表示，兩組比較時(shí)如果方差齊用t檢驗(yàn)，方差不齊用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作圖由GraphPad Prism6.0軟件提供。
　　結(jié)果:
　　1.本次實(shí)驗(yàn)化香樹(shù)果序醇提物出膏率為4.1％。化香樹(shù)果序醇提物的主要成分含黃酮類(lèi)物質(zhì)，與課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。
　　2.

10、化香樹(shù)果序醇提物在1.0mg/ml濃度下可誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞株SUNE1、CNE1和CNE2細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，空泡不斷相互融合、增大，細(xì)胞膜相互融合，最后細(xì)胞破裂，此期間細(xì)胞核無(wú)明顯改變。同時(shí)，5-8F細(xì)胞相同條件下加入1.0mg/ml濃度的化香樹(shù)果序醇提物未發(fā)生明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　3.根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)找到可能與methuosis死亡方式的發(fā)生有關(guān)的H-Ras/Arf6/Rac1信號(hào)通路。
　　4.RT-qPCR結(jié)

11、果顯示，化香樹(shù)果序醇提物干預(yù)后CNE1和CNE2細(xì)胞中H-Ras、Rac1和MAPK1基因表達(dá)量增加，Arf6、MAP K3和FOS基因表達(dá)量降低。
　　5.Western Blotting結(jié)果表明經(jīng)化香樹(shù)果序醇提物處理后CNE1、CNE2細(xì)胞中H-Ras和Rac1蛋白表達(dá)量均增加。
　　6.Rac1蛋白抑制劑EHT1864干預(yù)下，加了1.0mg/ml化香樹(shù)果序醇提物的CNE1、CNE2細(xì)胞不再發(fā)生methuosis死亡。<

12、br>　　結(jié)論:
　　1.乙醇回流法能夠得到成分穩(wěn)定的化香樹(shù)果序醇提物，該方法為一種潛在的可批量工業(yè)化生產(chǎn)香樹(shù)果序有效藥物成分的技術(shù)。
　　2.化香樹(shù)果序醇提物在1.0mg/ml濃度下時(shí)可誘導(dǎo)人鼻咽癌SUNE1、CNE1和CNE2細(xì)胞株發(fā)生methuosis死亡，但不能誘導(dǎo)5-8F細(xì)胞株發(fā)生methuosis死亡。
　　3.化香樹(shù)果序醇提物誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生methuosis死亡的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控RAS/Arf6/