莫能菌素對(duì)白藜蘆醇誘導(dǎo)A549細(xì)胞死亡的敏化及其機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的:白藜蘆醇（3,4’,5-trihydroxy-trans-stilbene，Resveratrol）屬多酚類化合物，廣泛存在于一些開花植物、花生及葡萄中。大量的體外研究表明，白藜蘆醇具有抗氧化、抗炎癥、抗病毒等多種生物活性。白藜蘆醇已被確定為有效的抗癌藥物，其對(duì)于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的作用。
　　有研究表明白藜蘆醇是通過一個(gè)被動(dòng)擴(kuò)散以及脂筏依賴性的胞吞過程被腫

2、瘤細(xì)胞所吸收的，而這個(gè)過程對(duì)于莫能菌素是敏感的。實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示白藜蘆醇處理A549細(xì)胞24h并無明顯的凋亡現(xiàn)象，不過Fas/Fas-L的表達(dá)是上調(diào)的。由于在細(xì)胞膜特定位點(diǎn)上配體被募集與受體分子形成復(fù)合物這一過程中脂筏扮演著重要角色，因此莫能菌素對(duì)于白藜蘆醇處理過程Fas介導(dǎo)凋亡的啟動(dòng)可能會(huì)有影響。
　　作為自噬抑制劑的莫能菌素單獨(dú)作用的細(xì)胞毒性較小，關(guān)于其與抗癌藥物聯(lián)用的效應(yīng)的研究較少。因此本研究以人肺腺癌上皮A549細(xì)胞為研

3、究模型，探究莫能菌素對(duì)于白藜蘆醇誘導(dǎo)A549細(xì)胞死亡的影響及作用機(jī)制，從而為莫能菌素結(jié)合抗癌藥物或者白藜蘆醇與其他自噬抑制劑聯(lián)用治療腫瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　目的：研究莫能菌素對(duì)白藜蘆醇誘導(dǎo)A549細(xì)胞死亡的敏化作用及其機(jī)制
　　材料和方法:用含10％超級(jí)新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70～80%融合，用抑制劑3-MA或Ivachtin預(yù)處理細(xì)胞1h，再用莫能菌素預(yù)處理細(xì)胞1h，

4、最后用含不同濃度的白藜蘆醇(0μM,50μM，100μM)的培養(yǎng)基處理細(xì)胞24小時(shí)。在倒置相差顯微鏡下觀察A549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；通過NBB染色的方法檢測(cè)細(xì)胞的存活率；通過DAPI染色在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核狀態(tài)分析細(xì)胞凋亡；免疫熒光，Western Blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)量以及在細(xì)胞中的亞定位。
　　結(jié)果:
　　1、NBB染色檢測(cè)及形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，低濃度范圍內(nèi)，莫能菌素對(duì)人野生型肺腺癌細(xì)胞的殺傷作用不明顯，高

5、濃度范圍內(nèi)則有一定的殺傷作用，且呈濃度依賴關(guān)系，而當(dāng)與白藜蘆醇共同作用時(shí)，無論莫能菌素濃度高低，細(xì)胞生存率均有顯著的下降。
　　2、免疫熒光及Western Blotting等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)顯示，用莫能菌素對(duì)A549細(xì)胞單獨(dú)處理24h時(shí)，LC-3水平顯著上調(diào)，存在濃度依賴性，當(dāng)莫能菌素與白藜蘆醇共同作用時(shí)，LC-3表達(dá)進(jìn)一步增加，且隨著白藜蘆醇濃度的升高而增強(qiáng)。
　　3、DAPI染色、免疫熒光、Western Blotting

6、等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)顯示，當(dāng)莫能菌素與白藜蘆醇共同作用時(shí)，A549細(xì)胞產(chǎn)生明顯的核皺縮現(xiàn)象，且隨著兩種藥物濃度的升高而增強(qiáng)。
　　4、免疫熒光、Western blotting等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)，自噬抑制劑3-MA的使用并未能有效的阻止莫能菌素對(duì)于A549細(xì)胞LC-3Ⅱ的上調(diào)，而且凋亡有進(jìn)一步增強(qiáng)的趨勢(shì)；而Caspase-3專一抑制劑Ivachtin的使用雖然一定程度上削弱了A549細(xì)胞Cleaved-Caspase-3的表達(dá)，而其剪切底物

7、生成產(chǎn)物Cleaved-PARP-1表達(dá)也有所下降，但仍處于較高水平同時(shí)自噬有增強(qiáng)的趨勢(shì)，不過DAPI染色卻顯示A549細(xì)胞核皺縮情況未有明顯的改善。此外，NBB染色及形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，兩種抑制劑的使用未能有效地使阻止莫能菌素與白藜蘆醇共同作用導(dǎo)致的A549細(xì)胞存活率下降以及形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)論:莫能菌素在低濃度下幾乎不抑制體外培養(yǎng)的人肺腺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，高濃度下有一定的抑制性，但是與白藜蘆醇共同作用下抑制效果更明顯，