臨床白色念珠菌流行病學研究和CaHtrAp絲氨酸蛋白酶功能初探.pdf

1、第一部分臨床白色念珠菌抗真菌藥物敏感性和MLST分型研究
　　目的：
　　監(jiān)測江西地區(qū)白色念珠菌對臨床常用抗真菌藥物敏感性，為臨床白色念珠菌感染的合理用藥提供流行病學依據(jù)。對白色念珠菌進行 MLST分型研究，分析其流行進化關(guān)系，查找本地區(qū)臨床白色念珠菌優(yōu)勢菌株。
　　方法：
　　1.分離和純化臨床菌株，利用 CHROMagar顯色培養(yǎng)和多重 PCR快速鑒定法鑒定白色念珠菌；
　　2.按照美國臨床試驗標準化研

2、究所（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）推薦的《酵母微量稀釋抗真菌藥物敏感性試驗參考方法第三版》（M27-A3）檢測白色念珠菌對兩性霉素 B（Amphotericin B，AMP B）、5-氟胞嘧啶（5-Flucytosine，5-FC）、氟康唑（Fluconazole，F(xiàn)CZ）、伊曲康唑（Itraconazole，ICZ）和酮康唑（Ketoconazole，KETO）等

3、5種臨床常見抗真菌藥物的敏感性；
　　3.利用基于DNA測序的多位點序列分型（Multi-locus sequence typing，MLST）方法對白色念珠菌進行基因分型；
　　4.使用MEGA6.0對MLST分型中出現(xiàn)的核苷酸多態(tài)性位點（single nucleotide polymorphism，SNP）進行分析，采用非加權(quán)組算數(shù)平均法（Unweighted Pair Group Method With Arithme

4、tic Mean，UPGMA）獲得最小生成樹，并以遺傳距離（p-distances）0.04為截斷值，分析白色念珠菌流行進化關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.本研究通過分離、純化和鑒定，共獲得185株白色念珠菌臨床分離株；
　　2.185株白色念珠菌主要來源于痰（103株，55.7％）、陰道或?qū)m頸分泌物（66株，35.7%）和尿液（10,5.4%）；
　　3.白色念珠菌對AMP B、5-FC、FCZ、ICZ和KETO耐

5、藥率分別為0.0%、2.7%、7.0%、5.4%和2.7%；
　　4. MLST基因分型共獲得122個雙倍體序列型（double sequence type, DST），其中DST2889~DST2899和DST2945~DST3032共99個為新發(fā)現(xiàn)DST，并已被PubMLST數(shù)據(jù)庫收錄；
　　5. MLST分型的7個管家基因片段核苷酸序列共2883bp，其中發(fā)現(xiàn)SNP有86個（3.1%）。片段AAT1a、AAC1、ADP

6、1、MPIb、SYA1、VPS13和ZWF1b分別發(fā)現(xiàn)SNP位點7個（7/373，1.9%）、10個（10/407，2.5%）、16個(16/443，3.6%)、16個(16/375，4.3%)、9個（9/391，2.3%)、16個(16/403，4.0%)和16個（16/491，3.3%)；
　　6.聚類分析發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌分為12個進化分支(n≥5)，其中Clade1含菌株數(shù)最多（56株，30.3%），其次分別是Clade2（

7、17株，9.2%）、Clade3（16株，8.6%）、Clade4（14株，7.6%）。
　　結(jié)論：
　　1.185株白色念珠菌抗真菌藥物敏感性與當前國內(nèi)其他地區(qū)研究結(jié)果基本一致；
　　2.本地區(qū)白色念珠菌臨床菌株之間有明顯的遺傳變異，122個雙倍體序列型中有99個是本研究新發(fā)現(xiàn)的，這些新發(fā)現(xiàn)的DST已被白色念珠菌MLST數(shù)據(jù)庫收錄；
　　3.聚類分析發(fā)現(xiàn)白色念珠菌分為12個進化分支，Clade1菌株數(shù)量最多，是

8、本地區(qū)白色念珠菌感染的優(yōu)勢菌群。
　　第二部分白色念珠菌CaHtrAp絲氨酸蛋白酶功能初探
　　目的：
　　闡明白色念珠菌 CaHtrA蛋白（ high-temperature requirement A protein, CaHtrAp）絲氨酸蛋白酶功能，并檢測水解活性絲氨酸殘基對其功能的影響。篩選與CaHtrAp相互作用的白色念珠菌蛋白，為進一步研究CaHtrAp功能及其在白色念珠菌致病過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

9、>　　方法：
　　1.使用NCBI Conserved domain prediction在線工具分析CaHtrAp保守結(jié)構(gòu)域；
　　2.使用Psort II在線工具分析CaHtrAp前導序列，并預測其亞細胞定位；
　　3.使用軟件ClustalX1.86比對分析CaHtrAp結(jié)構(gòu)域及其同源蛋白氨基酸序列；
　　4.利用PCR技術(shù)擴增出CaHtrAp N端功能DegQ結(jié)構(gòu)域（定義為CaHtrA1p）基因，將其定向

10、克隆至原核表達質(zhì)粒 pET-28c中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET28c-HtrA1；利用overlap PCR原理將CaHtrA1p絲氨酸殘基Ser219和Ser220突變成 Cys或 Ala，構(gòu)建成重組質(zhì)粒 pET28c-HtrA1S219A、pET28c-HtrA1S219C、 pET28c-HtrA1S220A、 pET28c-HtrA1S220C和pET28c-HtrA1S219/220A；重組表達質(zhì)粒使用菌液PCR、雙酶切鑒定和DN

11、A測序進行確認；
　　5.使用半乳糖苷類似物 IPTG誘導重組質(zhì)粒表達，使用超聲波破碎細胞壁后收集總蛋白，并利用鎳離子親和層析純化融合蛋白；
　　6.利用體外酶活性檢測反應，檢測 CaHtrA1p及其活性絲氨酸殘基突變體蛋白降解絲氨酸蛋白酶特異性底物β-casein活性，驗證 CaHtrA1p絲氨酸蛋白酶功能，以及Ser219和Ser220對其蛋白酶活性的影響；
　　7.通過使用融合蛋白CaHtrA1p免疫Babl/c

12、小鼠制備抗CaHtrA1p多克隆抗體；
　　8.利用免疫熒光技術(shù)，驗證CaHtrAp亞細胞定位；
　　9.使用體外免疫共沉淀技術(shù)和質(zhì)譜分析，篩選與CaHtrAp相互作用的白色念珠菌蛋白。質(zhì)譜分析陽性標準：唯一匹配肽段計數(shù)（UniquePepCount）≥2。
　　結(jié)果：
　　1.保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，CaHtrAp為雙DegQ結(jié)構(gòu)域蛋白，由2個絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域和4個PDZ結(jié)構(gòu)域組成；N端DegQ結(jié)構(gòu)域有胰酶樣絲氨

13、酸蛋白酶保守的―催化三分子（catalytic triad）‖（His105-Asp136-Ser220）基序（motif）；
　　2. Psort II分析結(jié)果表明，CaHtrAp沒有N端前導序列，也沒有核定位信號，被預測為胞質(zhì)蛋白；
　　3.氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，CaHtrAp N端DegQ具有催化三分子，預測的活性絲氨酸殘基 Ser220附近有保守序列 GSSGS，Ser219為 Ser220鄰近絲氨酸；而 C端DegQ

14、結(jié)構(gòu)域功能缺失；
　　4.菌液 PCR、雙酶切鑒定和 DNA測序結(jié)果表明，重組原核表達質(zhì)粒pET28c-HtrA1、 pET28c-HtrA1S219A、 pET28c-HtrA1S219C、pET28c-HtrA1S220A、pET28c-HtrA1S220C和pET28c-HtrA1S219/220A構(gòu)建成功；
　　5.體外誘導表達、純化和濃縮融合蛋白，融合蛋白CaHtrA1p、CaHtrA1S219Ap、CaHtrA1

15、S219Cp、CaHtrA1S220Ap、CaHtrA1S220Cp和CaHtrA1S219A/S220Ap定量濃度分別為2.4 mg/mL、1.84 mg/mL、2.00 mg/mL、1.52 mg/mL、1.45 mg/mL和1.90 mg/mL；
　　6.體外蛋白酶活性驗證結(jié)果表明，CaHtrA1p能夠降解底物β-casein，具有絲氨酸蛋白酶活性；在酶活性反應中，實驗組 CaHtrA1p、CaHtrA1S219Cp、CaH

16、trA1S220Cp、 CaHtrA1S220Ap、 CaHtrA1S219A/S220Ap和CaHtrA1S219Ap對底物β-casein的降解效率分別為0.84、0.74、0.66、0.46、0.42和0.35；
　　7. CaHtrAp免疫熒光結(jié)果表明：CaHtrAp定位于細胞質(zhì)，可能在細胞膜附近起作用；熒光半定量分析發(fā)現(xiàn)假菌絲細胞CaHtrAp表達水平顯著高于酵母相細胞（單位細胞面積光密度值0.23 vs.0.15, p

17、=0.002）；
　　8.免疫共沉淀技術(shù)和質(zhì)譜分析共篩選出8個與CaHtrAp相互作用蛋白，包括3個核糖體亞基蛋白（RPL3、RPS9B和RPS3）以及延伸因子1（elongation factor1-alpha，TEF1）、肌動蛋白（actin1，ACT1）、泛醇色素 C還原酶亞基2（ubiquinol-cytochrome c reductase core subunit2，QCR2）、細胞色素P450（ cytochrome

18、 P450， TRI4）和二氫硫辛酰胺脫氫酶（ dihydrolipoamide dehydrogenase1，LPD1）。
　　結(jié)論：
　　1. CaHtrA1p具有胰酶樣絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域和典型的絲氨酸蛋白酶活性；
　　2. Ser219和Ser220都對CaHtrA1p蛋白酶活性有重要影響，而且兩者之間存在協(xié)同效應；
　　3. CaHtrAp是一種細胞質(zhì)蛋白，可能與假菌絲形成有關(guān)；
　　4.本研究篩選