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1、β-胡蘿卜素作為一種天然色素,具有廣泛的生理功能,特別是在抗癌方面的功能越來(lái)越受到人們的關(guān)注。許多流行病學(xué)研究顯示β-胡蘿卜素能降低人乳腺癌的發(fā)病率,但是對(duì)于這種化學(xué)預(yù)防作用的分子機(jī)制并不是很明確。PPAR-γ的配體能夠促使乳腺癌分化和誘導(dǎo)其凋亡,但β-胡蘿卜素與PPAR-γ蛋白和mRNA表達(dá)的關(guān)系,以及PPAR-γ信號(hào)傳輸在β-胡蘿卜素抗癌中起的作用,至今還沒(méi)有人研究。因此本論文設(shè)計(jì)研究β-胡蘿卜素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制作用和P
2、PAR-γ表達(dá)之間的關(guān)系。(1)我們用Westernblot和RT-PCR技術(shù)從蛋白和mRNA水平來(lái)檢測(cè)β-胡蘿卜素對(duì)PPAR-γ表達(dá)的影響,以及檢測(cè)了β-胡蘿卜素對(duì)PPAR-γ下游相關(guān)基因COX-2,P21WAF1/CIP1和P27mRNA表達(dá)的影響,研究β-胡蘿卜素與PPAR-γ的關(guān)系;(2)用MTT檢測(cè)β-胡蘿卜素對(duì)細(xì)胞活力的影響,用流式細(xì)胞技術(shù)和核染色技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡,C-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及激光共聚焦顯微鏡觀察,及用Wester
3、nblot檢測(cè)胞漿中細(xì)胞色素C的釋放;用熒光探針測(cè)細(xì)胞中活性氧水平的上升等,從形態(tài)上及分子水平研究β-胡蘿卜素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用,以及β-胡蘿卜素通過(guò)調(diào)節(jié)PPAR-γ和活性氧在抗癌的作用中的分子機(jī)制。研究結(jié)果如下: 1.β-胡蘿卜素上調(diào)PPAR-γ基因mRNA和蛋白的表達(dá) β-胡蘿卜素能呈時(shí)間效應(yīng)從mRNA水平和蛋白水平顯著上調(diào)PPAR-γ的表達(dá),經(jīng)β-胡蘿卜素處理3天后,PPAR-γmRNA和蛋白水平分別增加為對(duì)照組的
4、1.7倍和3.5倍。經(jīng)PPAR-γ的抑制劑GW9662預(yù)處理,能顯著削弱由β-胡蘿卜素引起的PPAR-γ的上調(diào)。 2.β-胡蘿卜素對(duì)COX-2,P21和P27基因表達(dá)的影響 β-胡蘿卜素呈時(shí)間效應(yīng)下調(diào)COX-2基因的表達(dá),上調(diào)p21WAF1/CIP1基因的表達(dá),且PPAR-γ的抑制劑GW9662能顯著削弱由β-胡蘿卜素引起的COX-2,p21WAFI/CIP1的表達(dá)變化。β-胡蘿卜素對(duì)P27基因表達(dá)的影響不顯著。
5、 由上面的結(jié)果可知,β-胡蘿卜素不僅能上調(diào)PPAR-γ的表達(dá),并能通過(guò)PPAR-γ信號(hào)傳輸調(diào)節(jié)P21和COX-2基因。 3.β-胡蘿卜素對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制與誘導(dǎo)凋亡 用20μmol/L和50μmol/Lβ-胡蘿卜素處理MCF-7細(xì)胞3天,細(xì)胞的活力分別為對(duì)照組的70%和50%。β-胡蘿卜素對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的抑制也呈時(shí)間效應(yīng)關(guān)系,使用50μmol/Lβ-胡蘿卜素,當(dāng)將處理時(shí)間從1天延長(zhǎng)到4天時(shí),細(xì)胞活力從71%
6、降為42%。 作為PPAR-γ抑制劑的GW9662和/或GSH能夠削弱β-胡蘿卜素誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的下降,5μmol/LGW9662預(yù)處理能部分挽回β-胡蘿卜素誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的下降,而10μmol/LGW9662預(yù)處理部分增強(qiáng)β-胡蘿卜素誘導(dǎo)細(xì)胞活力的下降。GSH能呈劑量效應(yīng)抑制β-胡蘿卜素對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用,用200μmol/LGSH預(yù)處理細(xì)胞,能使細(xì)胞活力由50%恢復(fù)到70%,且5μmol/LGW9662共同預(yù)處理能增加GS
7、H對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。 50μmol/Lβ-胡蘿卜素處理3天能顯著增加細(xì)胞早期的凋亡率,用GW9662或GSH能削弱這種作用,且共同使用GW9662和GSH有協(xié)同作用。β-胡蘿卜素對(duì)MCF-7細(xì)胞的周期沒(méi)有明顯的影響。 4.β-胡蘿卜素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)的變化 β-胡蘿卜素處理的細(xì)胞,細(xì)胞核變小,濃縮,熒光加強(qiáng)和成核碎片等,細(xì)胞呈凋亡狀態(tài)。200μmol/LGSH預(yù)處理能明顯減少細(xì)胞核的形態(tài)變化,200
8、μmol/LGSH和5μmol/LGW9662預(yù)處理能明顯減少細(xì)胞核的形態(tài)變化。單獨(dú)用GW9662預(yù)處理,對(duì)由β-胡蘿卜素誘導(dǎo)的細(xì)胞核的變化的影響不明顯。 5.β-胡蘿卜素使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平上升 用50μmol/Lβ-胡蘿卜素處理3天后,細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯比對(duì)照組高,且用200μmol/LGSH預(yù)處理能顯著抑制這種升高。用GW9662預(yù)處理不能降低由β-胡蘿卜素引起的活性氧的增加,并且10μmol/LGW9662能使細(xì)
9、胞內(nèi)活性氧增加為對(duì)照組的120%。 6.β-胡蘿卜素誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放 50μmol/Lβ-胡蘿卜素處理3天后,紅色和綠色有所分離,說(shuō)明細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放出來(lái),跑到了胞漿里。通過(guò)westernblot檢測(cè),進(jìn)一步表明β-胡蘿卜素誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放,200μmol/LGSH或200μmol/LGSH+5μmol/LGW9662能夠抑制細(xì)胞色素C的釋放。 綜合前人的工作及我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),我們有理由認(rèn)為,PP
10、AR-γ傳輸系統(tǒng)和活性氧的產(chǎn)生,可能在β-胡蘿卜素抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡方面的分子機(jī)制中都起到了重要的作用。并且,由于GW9662和GSH共同預(yù)處理作用效果更好,這兩個(gè)途徑可能有協(xié)同作用。 結(jié)果顯示,β-胡蘿卜素能顯著抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng),且β-胡蘿卜素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系;β-胡蘿卜素能夠呈時(shí)間效應(yīng)從mRNA和蛋白水平顯著上調(diào)PPAR-γ的表達(dá),且β-胡蘿卜素能夠通過(guò)PPAR-γ調(diào)節(jié)P21W
11、AF1/CIP1mRNA和COX-2mRNA水平;用PPAR-γ的抑制劑GW9662預(yù)處理能夠部分阻止由β-胡蘿卜素引起的細(xì)胞活力下降和誘導(dǎo)的凋亡率;研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ的表達(dá)和ROS的產(chǎn)生在β-胡蘿卜素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起到了重要的作用,β-胡蘿卜素可以導(dǎo)致細(xì)胞中線粒體的損傷和細(xì)胞色素C的釋放;用GSH預(yù)處理能夠降低由β-胡蘿卜素引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的增高并阻止細(xì)胞色素C的釋放和細(xì)胞凋亡,GSH和GW9662同時(shí)作用可以加強(qiáng)這種效應(yīng)。綜
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