基于卟啉的仿酶組裝及其生物識別分析應(yīng)用.pdf

1、高靈敏度、廣通用性的生化分析方法對于生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品學(xué)等學(xué)科的發(fā)展至關(guān)重要。通常相應(yīng)的特異性分析方法主要利用生物酶作為分子標(biāo)記進(jìn)行信號轉(zhuǎn)換，將生物分子識別反應(yīng)信號轉(zhuǎn)換為其他更容易檢測的物理化學(xué)信號。然而，生物酶在穩(wěn)定性、實(shí)用性等方面并不能滿足臨床和超靈敏分析的要求，因此尋找新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)記分子是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。其中，借鑒天然酶等的結(jié)構(gòu)，利用生物或納米材料等仿生組裝合成可替代的模擬酶的信號標(biāo)記是其中最有效的途徑。
　　卟啉是

2、過氧化物酶、血紅素、細(xì)胞色素和葉綠素等生物大分子的核心部分，基于卟啉分子的仿生組裝體系在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)有了極其豐富的工作。就其研究方向來說，主要是通過卟啉分子的自身的催化性能，與其他生物或納米材料通過簡單吸附結(jié)合克服卟啉單體自身的聚集效應(yīng)，其組裝后的仿生體在結(jié)構(gòu)上與天然酶的結(jié)構(gòu)相差較遠(yuǎn)，且組裝過程和催化機(jī)理的研究并不清楚;另一方面，基于卟啉分子的光電性能的仿生組裝研究的更是較少涉及。因此，探討卟啉的催化機(jī)理，選擇更好仿生組裝材料

3、來模擬天然酶結(jié)構(gòu)，合成信號轉(zhuǎn)換效率高和穩(wěn)定性好仿生組裝體十分重要。
　　本論文以卟啉的仿生組裝為核心，嘗試?yán)枚喾N材料實(shí)現(xiàn)對過氧化物酶結(jié)構(gòu)和催化功能的仿生模擬，改善卟啉單體的催化性能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，結(jié)合生物分子識別反應(yīng)構(gòu)建特異性的生化檢測方法，開展生物化學(xué)分析，將包括五部分工作:
　　1、基于過氧化物酶的SPR-DNA傳感器的研發(fā)
　　辣根過氧化物酶是以鐵卟啉為輔基的亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，催化過氧化物反應(yīng)，廣泛用于各類生

4、化檢測項(xiàng)目。因此，本工作發(fā)展了基于天然辣根過氧化物酶催化聚合反應(yīng)的表面等離子共振(Surface plasmon resonance，簡稱SPR)基DNA傳感檢測方法，利用非共價(jià)功能化的石墨烯納米片作為傳感基底，并以酶催化誘導(dǎo)的聚合反應(yīng)作為質(zhì)量增強(qiáng)劑。該傳感器設(shè)計(jì)方案有多方面目標(biāo):首先，通過電化學(xué)沉積的方法原位氧還原石墨烯薄膜，并以此優(yōu)化SPR金膜的基底，由原子力顯微拓?fù)鋱D技術(shù)表征該過程，最終使總體的SPR信號響應(yīng)更加靈敏。其次，以鎳離

5、子螯合的胺基三乙酸作為分子支架，苝基衍生物以π-π共軛吸附在石墨烯支撐的SPR金片表面，以鎳離子的存在使其支架分子保持一定的組裝方向，隨后在生物素鰲合在介質(zhì)表面，捕獲探針與生物素相連后可以實(shí)現(xiàn)自組裝，且維持特定的方向。最后，借鑒夾心免疫分析策略，在目標(biāo)DNA結(jié)合在探針表面后，辣根過氧化物酶標(biāo)記的報(bào)告DNA，實(shí)現(xiàn)酶標(biāo)記單元的結(jié)合，實(shí)時(shí)地將苯胺作為質(zhì)量增強(qiáng)信號單位劑轉(zhuǎn)化為大分子聚苯胺沉淀，協(xié)同實(shí)現(xiàn)信號的放大。運(yùn)用上述配置，得到對特異性DNA

6、精確檢測且可重現(xiàn)檢測的平臺，檢測下限達(dá)到飛摩爾水平，該部分工作實(shí)現(xiàn)了以天然酶為信號標(biāo)記的沉積反應(yīng)放大SPR-DNA檢測靈敏度。
　　2、基于卟啉與dsDNA仿生組裝催化的SPR-DNA傳感器
　　該部分設(shè)計(jì)一種基于“仿生組裝的催化沉積”的免標(biāo)記、超靈敏表面等離子體共振(SPR)核酸分析策略。首先在SPR金片表面以自組裝的方式結(jié)合肽核酸作為捕獲探針，使其可進(jìn)一步與目標(biāo)DNA雜交。當(dāng)捕獲探針與目標(biāo)DNA雜交后，目標(biāo)DNA末端暴露

7、出的部分核酸序列可以打開頸環(huán)結(jié)構(gòu)DNA(H1，H2)引發(fā)雜交鏈聚合反應(yīng)(HCR)，形成具有一定長度的納米級DNA雙鏈。基于文獻(xiàn)可知卟啉分子可以通過“溝槽嵌入”技術(shù)結(jié)合到DNA雙鏈雙螺旋結(jié)構(gòu)的大溝槽內(nèi)。帶正電荷的對稱結(jié)構(gòu)卟啉FeⅢmeso-tetra(N-methyl-4-pyridyl)porphine(FeTMPyP)可適時(shí)、動(dòng)態(tài)地與雙鏈DNA結(jié)合組裝成卟啉-dsDNA結(jié)構(gòu)。由于FeTMPyP作為一種高效的催化劑，DNA雙螺旋大溝槽結(jié)

8、構(gòu)可以作為附載體結(jié)合大量FeTMPyP形成具有高催化活性，快速催化動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和更高的穩(wěn)定性的仿生催化劑。該仿生催化劑以4-氯-1-萘酚作為電子供體，催化其還原雙氧水，并將4-氯-1-萘酚氧化為不溶性的沉淀物沉積在SPR金片界面，達(dá)到典型的SPR信號放大效應(yīng)。該部分工作實(shí)現(xiàn)了對天然酶催化功能的模擬，到達(dá)了提高檢測靈敏度的效果。
　　3、基于同步生成銅膠束的催化沉淀的SPR-DNA傳感器
　　該部分以DNA為模板原位合成銅納米膠

9、束，并可以吸附催化基于納米材料的比表面積來實(shí)現(xiàn)信號放大。首先，通過優(yōu)化探針序列選擇合適探針序列，同時(shí)目標(biāo)DNA作為橋梁分子可組裝在探針DNA層，并開啟TdT酶延長DNA鏈反應(yīng)，該過程可有SPR實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)控并作為第一步放大反應(yīng)。接著，由于合成的DNA模板鏈存在，納米銅膠束可以在DNA骨架上合成，通過銅離子吸附在DNA骨架表面，而后抗壞血酸鈉還原形成銅膠束。該過程有電子投射顯微鏡(TEM)和電化學(xué)等技術(shù)進(jìn)行表征，并可以在SPR信號上檢測到第

10、二步放大反應(yīng)。最后，由于存在銅膠束的納米比表面積，故兒茶酚紫可吸附在其表面并在雙氧水催化下形成寡聚物，沉積在SPR金片表面。最后導(dǎo)致電化學(xué)信號的增加和SPR信號的第三步放大。通過以上三重放大反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對3.21飛摩爾濃度檢測，該部分工作展現(xiàn)了多種放大技術(shù)和納米材料在SPR放大方面的應(yīng)用潛力。
　　4、基于卟啉與類石墨烯納米片仿生組裝的ECL病毒基因檢測
　　該部分合成一種有高催化性能和良好延展性的二維石墨烯片實(shí)現(xiàn)卟啉分子的仿生

11、組裝，以達(dá)到和天然酶類似的催化效果，繼而設(shè)計(jì)檢測流感病毒基因的電致化學(xué)發(fā)光傳感器。其基本思想是從結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)層面，對天然酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行解構(gòu)與仿生重建。提取過氧化物酶的酶促反應(yīng)活性中心-卟啉，以廉價(jià)均質(zhì)、具有類石墨烯結(jié)構(gòu)的二維納米氮化碳單層材料作為載體逼近并還原該輔基的化學(xué)環(huán)境，耦合簡易的取代基修飾、π-π共軛和軸向配位的組裝方式，實(shí)現(xiàn)在結(jié)構(gòu)上對天然酶的模擬;并進(jìn)一步以酶促反應(yīng)涉及的若干動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如米氏常數(shù)（KM）等作為主要技術(shù)指標(biāo)，通

12、過聯(lián)用多種先進(jìn)的表征分析手段比較并驗(yàn)證模擬酶在活性上與天然酶相當(dāng)。以H7N9病毒亞基相互作用的核酸序列作為捕獲探針，將該探針組裝在量子點(diǎn)電極表面，當(dāng)有H7N9病毒亞基存在時(shí)，捕獲探針?biāo)缮⒌摹邦i環(huán)”結(jié)構(gòu)打開，剛性的雙鏈結(jié)構(gòu)使其末端生物素暴露，通過生物素與親和素的反應(yīng)，將親和素修飾的模擬酶標(biāo)記組裝到電極表面，消耗共反應(yīng)劑過氧化氫以衰減量子點(diǎn)的發(fā)光實(shí)現(xiàn)對DNA的靈敏檢測。該部分工作實(shí)現(xiàn)了對天然酶結(jié)構(gòu)和功能的雙重模擬，提高了模擬酶的穩(wěn)定性，可作

13、為天然酶的替代物。
　　5、基于卟啉與生物蛋白仿生組裝的免疫識別反應(yīng)ECL傳感器
　　受綠色熒光蛋白結(jié)構(gòu)性能的啟發(fā)，這部分用Zinc proto-porphyrin IX(ZnPPIX)取代天然血紅蛋白空穴中的輔基，合成可自身發(fā)光的重構(gòu)ECL生物大分子蛋白，進(jìn)而用于早期癌癥的檢測。該重構(gòu)蛋白在均相體系中合成、發(fā)光波長藍(lán)移至遠(yuǎn)紅光區(qū)的638 nm、可通過電激發(fā)紅光ECL信號并簡稱為重構(gòu)ECL蛋白（RErP）。重構(gòu)所用輔基和RE

14、rP結(jié)構(gòu)可分別用紫外和圓二色光譜(CD)進(jìn)行表征。同時(shí)，其結(jié)構(gòu)特征中關(guān)鍵的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合力等性能參數(shù)可用表面等離子體共振(SPR)進(jìn)行研究。其親和素修飾過程可用質(zhì)譜和紫外光譜等技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。熒光技術(shù)重點(diǎn)研究了該重構(gòu)蛋白的光學(xué)性能和ECL性能，最終證明其是一個(gè)可通用的和高光學(xué)性能的發(fā)光體。另一方面，單線態(tài)的卟啉可進(jìn)行多維標(biāo)記和自我多重光學(xué)放大，可擺脫對納米材料的依賴。同時(shí)其光學(xué)耐受性的轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)直接來自于RErP蛋白自身對單線態(tài)氧分子的催化