原卟啉鈉的制備工藝及其生物活性研究.pdf

1、目的：優(yōu)化利用非抗凝豬血制備原卟啉鈉(NAPP)的工藝，在此基礎(chǔ)上研究NAPP對四氯化碳(CCl4)所致小鼠急性肝損傷的保護作用及其機制和體外對人肝癌細胞株SMMC-7721細胞的抑制作用及體外抗乙型肝炎病毒(HBV)作用。
　　 方法：先以非抗凝豬血為原料提取出血紅素，再由血紅素經(jīng)原卟啉二甲酯直接制得NAPP；利用紫外-可見吸收光譜與紅外光譜對提取的血紅素和制備的NAPP進行定性檢測，并利用紫外分光光度法對二者進行定量檢測并計

2、算純度；通過單因素試驗和正交試驗2種方法對利用非抗凝豬血制備NAPP的工藝進行優(yōu)化，確定最佳工藝參數(shù)。60只ICR小鼠隨機分為正常對照組、CCl4模型組、聯(lián)苯雙酯組、NAPP低、中、高劑量組，每組10只；各治療組每天灌胃給予聯(lián)苯雙酯(200mg/kg)或不同劑量(30，60，120mg/kg)的NAPP，連續(xù)10d后，一次性腹腔注射CCl4(60mg/kg)建立急性肝損傷模型；16h后，各組小鼠摘眼球取血測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷

3、草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活力；剖腹取肝，稱重，計算肝臟指數(shù)；制備肝組織勻漿測定過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量，并觀察肝組織病理學變化。通過對人正常肝細胞株QSG-7701細胞的藥物毒性實驗篩選NAPP對人正常肝細胞無明顯毒性的最大無毒濃度(TC0)；以TC0為起始濃度，10倍梯度稀釋成5個不同的NAPP濃度，作用于體外培養(yǎng)的人肝癌細胞株SMMC-7721細胞，采用M

4、TT法測定NAPP對SMMC-7721細胞的增殖抑制作用；經(jīng)倒置顯微鏡和Hoechst33258染色倒置熒光顯微鏡進行形態(tài)學觀察，計數(shù)凋亡細胞，并計算凋亡指數(shù)(AI)；流式細胞術(shù)測定SMMC-7721細胞的細胞周期分布和凋亡、壞死率。以不同濃度NAPP作用于體外培養(yǎng)的HepG2.2.15細胞4d后，采用MTT法、時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)和聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)探討NAPP對HepG2.2.15細胞的細胞毒性作用及其分泌

5、HBsAg、HBeAg、前S1抗原(Pre-S1Ag)的影響；通過實時熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測NAPP對HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清液中HBV-DNA復制的抑制作用。
　　 結(jié)果：優(yōu)化了以非抗凝豬血為原料制備NAPP的工藝，1kg非抗凝豬血平均可以提取出10.6g血紅素，每5g血紅素平均可以制得3.46g NAPP;經(jīng)檢測，提取的血紅素純度達90.8％，制備的NAPP純度為88.8％：經(jīng)單因素試驗和正交試驗，提取血

6、紅素時，確定的最佳提取工藝為：勻漿5min，勻漿后加入等體積雙蒸水，V鹽酸丙?。篤溶血液=5：1，攪拌抽提10min;制備NAPP時，確定的最佳制備工藝是：酯化時甲醇用量為70mL，皂化時氫氧化鈉甲醇溶液用量為80mL，90℃加熱回流2.0h。與CCl4模型組比較，各治療組小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT和AST活性不同程度降低(P＜0.05，P＜0.01)，肝組織勻漿中CAT、GSH-Px、SOD活力不同程度升高(P＜0.05，P＜0.01)

7、，MDA含量不同程度降低(P＜0.05，P＜0.01)；病理切片也表明，NAPP各治療組小鼠肝損傷不同程度減輕，其中高劑量組肝損傷程度最輕。不同濃度NAPP作用后，SMMC-7721細胞的增殖明顯受到抑制，OD值明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，且抑制率高低與濃度和作用時間呈一定的依賴性；光學顯微鏡下見細胞個數(shù)明顯減少，細胞密度明顯變稀，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，很多細胞間的連接消失，細胞變圓、皺縮或見細胞外形變長呈長梭形；熒光顯微

8、鏡下細胞呈典型的凋亡形態(tài)學改變，AI顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；經(jīng)流式細胞儀檢測，可見SMMC-7721細胞凋亡率不同程度升高，細胞周期被阻滯于G2/M期。NAPP在0.01～100μg/mL濃度范圍內(nèi)對HepG2.2.15細胞沒有明顯的細胞毒性作用，半數(shù)毒性濃度(TC50)為4654μg/mL; NAPP在0.01～100μg/mL濃度范圍內(nèi)，對HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清液中的HBsAg、HBeAg和Pre-S1Ag

9、及HBV-DNA均有一定的抑制作用，其對四者的治療指數(shù)(TI)也分別為119、27、19和83。
　　 結(jié)論：優(yōu)化了從非抗凝豬血制備NAPP的工藝，該制備工藝切實可行，具有操作簡便，原料易得，制備周期短，成本低，產(chǎn)量較高，是一種較理想的制備NAPP方法，為充分利用我國豐富的豬血資源提供了切實可行的技術(shù)路線。一方面，NAPP可能通過阻止抗氧化酶活性降低和抗脂質(zhì)過氧化作用的途徑對CCl4所致小鼠急性肝損傷具有明顯的保護作用。另一方面