不同水解度花生多肽的制備及其生物活性研究.pdf

1、本課題運(yùn)用化學(xué)分析方法、現(xiàn)代儀器手段,生物學(xué)前沿技術(shù),首次系統(tǒng)地探討了不同水解度花生多肽的制備技術(shù)、低水解度多肽中血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(angiotensinconverting enzyme,ACE)抑制活性的肽段序列的檢測(cè),以及高水解度花生多肽的生物活性研究等問(wèn)題。研究結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)如下:
　　 1.不同水解度的花生多肽的制備與分析
　　 本文以冷榨花生餅為原料(粗蛋白含量50.47％),采用堿性蛋白酶(AlkalineP

2、roteause,Alcalase)水解制備了不同水解度的花生多肽。低度水解花生多肽:HD<15％；高度水解花生多肽:HD>15％。
　　 高水解度花生多肽的最佳制備技術(shù)條件為:
　　 加酶量75 U/g、酶解溫度44.9～47.6℃、pH7.93～8.15、酶解時(shí)間2.46～2.76 h。所得花生蛋白最高水解度為19.61％,花生多肽得率為95.87％。花生多肽平均相對(duì)分子量(MW)為543.0,平均肽鏈長(zhǎng)度(PCL)

3、為5.10。其中可溶性短肽含量(TCA-NSI)占花生多肽總量的87.76％。
　　 在上述基礎(chǔ)上建立了低水解度花生多肽的制備技術(shù)。
　　 通過(guò)高效液相色譜(HPLC)分析了花生多肽的分子量分布及氨基酸的組成和含量。花生多肽的分子量主要集中在3000以下,特別是分子量1000以下含量高達(dá)84.73％,這部分組分的平均相對(duì)分子量(MW)為543.0,平均肽鏈長(zhǎng)度(PCL)為5.10。花生多肽超濾截留組分(MW3000)得率

4、為86.79％,TCA-NSI為90.87％。分子量1000以下小肽混合物的含量升為90.53％。這部分組分的平均相對(duì)分子量(MW)為506.7,PCL為4.77?；ㄉ嚯陌被峤M成與花生蛋白相比,花生多肽的谷氨酸、精氨酸含量提高2.4％和4.1％,芳香族氨基酸含量也有增加(0.4％)。
　　 2.不同水解度花生多肽生物活性的研究
　　 2.1低水解度花生多肽生物活性的研究
　　 低水解度花生多肽抑制血管緊張肽轉(zhuǎn)

5、化酶ACE活性的研究及其特定肽段序列CR-7的檢測(cè)。首先采用高壓液相色譜、質(zhì)譜技術(shù)以及ACE生物活性抑制實(shí)驗(yàn)等對(duì)化學(xué)合成標(biāo)樣CR-7(氨基酸序列為Cys-Val-Thr-Pro-Ala-Leu-Arg)的化學(xué)特性和生物活性進(jìn)行了表征。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行了多肽CR-7免疫抗原的合成,通過(guò)動(dòng)物免疫制備了抗CR-7血清,采用Western印跡法、Dot blotting斑點(diǎn)雜交技術(shù)等,成功檢測(cè)到花生蛋白、低度水解花生多肽中抑制A

6、CE活性的特定肽段序列CR-7,并對(duì)其進(jìn)行初步定量分析。
　　 結(jié)果表明:花生分離蛋白的肽鏈中存在CR-7肽段序列,兩條陽(yáng)性反應(yīng)帶的分子量范圍分別在18KD～25 KD、25KD～35 KD之間?；ㄉ嚯闹蠧R-7特征肽段序列的相對(duì)含量高于花生蛋白中的含量,低度水解花生多肽中CR-7肽段序列的相對(duì)含量在HD>15％的范圍內(nèi),存在先升高后降低的趨勢(shì),這趨勢(shì)在一定范圍內(nèi)和花生多肽對(duì)ACE活性的抑制作用趨勢(shì)相符,說(shuō)明CR-7肽段序列在

7、花生ACE抑制肽的研究中占有重要的地位。
　　 2.2高水解度花生多肽體生物活性研究
　　 2.2.1高水解度花生多肽體外抗氧化活性研究
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)羥自由基、紅細(xì)胞溶血、肝臟與肝線(xiàn)粒體中的脂質(zhì)過(guò)氧化以及肝線(xiàn)粒體腫脹度的測(cè)定,結(jié)果表明高度水解花生多肽能有效地清除羥自由基,抑制由羥自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化作用,在保護(hù)生物膜、減少紅細(xì)胞溶血、減輕肝線(xiàn)粒體腫脹程度的作用方面,提示其具有很強(qiáng)的抗氧化能力。
　　

8、 分別運(yùn)用鄰苯三酚.魯米諾、CuSO4-Phen-VC-H2O2和雙氧水-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定了高度水解花生多肽對(duì)超氧陰離子、羥基自由基、體外雙氧水的清除作用,采用CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA體系測(cè)定了花生多肽對(duì)體外DNA損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高水解度花生多肽具有較好的體外清除活性氧和DNA損傷的保護(hù)作用。
　　 2.2.2高水解度花生多肽對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)活性研究
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高度水

9、解花生多肽能夠增加小鼠的體重、臟器重量和臟器指數(shù)、免疫器官重量和指數(shù)。通過(guò)病理切片觀(guān)察小鼠脾臟組織發(fā)現(xiàn)中、高劑量花生多肽(200mg/kg.d和400mg/kg.d)小鼠淋巴小結(jié)生發(fā)中心擴(kuò)張,脾臟中網(wǎng)狀細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)目的體積和數(shù)量增加,這提示花生多肽有提高機(jī)體免疫的作用；花生多肽對(duì)胸腺?zèng)]有明顯的影響。
　　 對(duì)動(dòng)物進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn),測(cè)定2,4-二硝基氟苯(DNFB)致敏的遲發(fā)性超敏反應(yīng)、自然殺傷(NK)細(xì)胞活性和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能

10、,放射免疫分析(RIA)方法測(cè)定血清免疫球蛋白(IgG)含量,酶聯(lián)免疫(ELLSA)方法測(cè)定白介素-1(IL-1)含量。結(jié)果表明:中、高劑量的花生多肽(200mg/kg.d和400mg/kg.d)能夠調(diào)節(jié)遲發(fā)性超敏反應(yīng)和NK細(xì)胞活性,增加IL-1和血清IgG的含量,提高腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力。這說(shuō)明中、高劑量的花生多肽能提高機(jī)體的免疫能力。
　　 2.2.3高水解度花生多肽抗突變活性的研究
　　 應(yīng)用經(jīng)典的Ames試驗(yàn)和小

11、鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞(Polychromatic erythrocytes,PCE)微核試驗(yàn)檢測(cè)花生多肽的抗突變作用。研究結(jié)果表明:不同濃度的花生多肽對(duì)不同誘變劑誘導(dǎo)的不同Ames菌株回復(fù)突變無(wú)抑制作用,但其對(duì)環(huán)磷酰胺誘發(fā)的小鼠骨髓微核的發(fā)生有抑制作用,且呈劑量一效應(yīng)關(guān)系。與致突變物環(huán)磷酰胺(Cy)對(duì)照組比較,200mg/Kg劑量組對(duì)Cy誘導(dǎo)的小鼠骨髓PCE微核形成的抑制率為33.79％,具有顯著性(P<0.05)。由此可見(jiàn),花生多肽對(duì)對(duì)