薤白多糖的制備、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及其生物活性研究.pdf

1、目前有關(guān)多糖的研究已成為天然藥物及保健品研發(fā)中的重要組成部分，國外大部分制藥公司都有糖類藥物研發(fā)項目。作為天然生物活性成分，研究已發(fā)現(xiàn)多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等多種功能。薤白(Allium macrostemon Bunge)為蔥屬多年生草本植物，廣泛分布于中國、日本和韓國等國的平原地區(qū)，多食用，其干燥鱗莖也可入藥。截至目前，對薤白的研究國內(nèi)外主要集中在其揮發(fā)油及單體化合物等方面，有關(guān)薤白多糖的研究還很不完善，尚未做較為深

2、入系統(tǒng)的研究。鑒于此，為了對現(xiàn)代多糖類保健食品或糖類藥物的開發(fā)奠定技術(shù)基礎(chǔ)，為薤白及其方劑的進一步應用提供理論基礎(chǔ)，同時在理論上、學術(shù)上及生產(chǎn)實踐上為我國活性多糖研究與開發(fā)利用提供更多的參考資料，本文擬對薤白多糖從提取工藝優(yōu)化、純品制備、結(jié)構(gòu)分析鑒定、活性篩選評價及結(jié)構(gòu)和功能的構(gòu)效關(guān)系等方面進行較為系統(tǒng)深入的研究，通過對這些問題的闡釋，不僅有助于充分開發(fā)利用我國的蔥屬植物資源，拓寬其應用范圍，而且對于其做為傳統(tǒng)藥物作用機制的揭示，也具有

3、一定的科學價值。
　　 本文首先以單因素提取實驗為基礎(chǔ)，結(jié)合響應面優(yōu)化法，對薤白多糖的分離提取工藝進行了優(yōu)化，得出實現(xiàn)薤白多糖高效提取的最佳工藝條件。在此條件下，采用分步醇沉技術(shù)對薤白多糖水浸提液進行分段沉降，得到薤白粗多糖。而后采用離子交換柱層析和凝膠柱層析相結(jié)合的方法，純化分離得到均一多糖。通過對薤白多糖的總糖含量(苯酚-硫酸法)、蛋白質(zhì)含量(考馬斯亮藍法)、糖醛酸含量(硫酸-間羥聯(lián)苯法)、硫酸基含量(氯化鋇-明膠比色法)的

4、測定，初步了解其理化性質(zhì)，然后應用GC、HPLC、IR、NMR、GC/MS等儀器及結(jié)合高碘酸氧化、Smith降解、甲基化等化學手段分析薤白多糖，探討薤白多糖各純化組分的分子量、單糖組成、結(jié)構(gòu)特征。最后對薤白多糖采用體外抗氧化活性、抗腫瘤活性、抑菌活性、神經(jīng)營養(yǎng)活性以及小鼠體內(nèi)化學急性肝損傷等模型進行活性篩選，評價其活性，并探討了薤白多糖活性與結(jié)構(gòu)的初步關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、薤白多糖提取條件的響應面法優(yōu)化研究本研究采

5、用響應曲面法，優(yōu)化薤白多糖提取工藝條件。首先選擇提取溫度、水料比、提取時間及提取次數(shù)4個因素進行單因素實驗，比較多糖得率，確定提取溫度90℃、水料比12 mL/g、提取時間90 min及提取次數(shù)2次為中心實驗點。在此基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken實驗設(shè)計法，進行4因素3水平響應曲面法實驗，同時進行統(tǒng)計分析，從而優(yōu)化出薤白多糖最佳提取工藝條件為提取溫度87℃，水料比12 mL/g，提取時間100 min以及提取次數(shù)3次，在此條件下，薤

6、白多糖得率預測值為25.51％，實驗值為25.49％,數(shù)據(jù)分析表明實驗值與預測值間存在較好的一致性。此優(yōu)化條件的得出為進一步開發(fā)和利用薤白多糖提供了基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)和理論分析依據(jù)。
　　 2、多糖提取、分離純化、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析通過對薤白干燥鱗莖進行預處理后，經(jīng)干燥、粉碎、熱水提取、40％，60％和80％乙醇分步沉淀、離心，凍干，分別得到三種級分的薤白粗多糖AMP40、AMP60和AMP80，其提取率分別為3.2％、11.8％和9

7、.8％。AMP40、AMP60和AMP80再經(jīng)過陰離子交換色譜(DEAE-纖維素)和凝膠過濾色譜(Sephadex G-100)進一步分離純化，得到四個薤白多糖純化組分(AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1和AMP80-1)。分別采用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍法、硫酸-間羥聯(lián)苯法、氯化鋇-明膠法對薤白粗多糖(AMP40、AMP60及AMP80)和純化組分(AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1及AMP80-1)中總糖、蛋

8、白質(zhì)、糖醛酸、硫酸基含量進行了分析。結(jié)果表明，各多糖組分不合蛋白質(zhì)，硫酸基含量普遍較低，但薤白粗多糖AMP40的糖醛酸含量達12.56％，遠高于AMP60和AMP80，AMP40經(jīng)純化后，AMP40-2中糖醛酸的含量更是高達30.22％，遠高于其它薤白多糖。
　　 采用高效液相凝膠滲透色譜法對薤白多糖純化組分AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1及AMP80-1的均一性進行了鑒定，同時測定了其相對分子質(zhì)量，分別為18.2

9、kDa、105.0 kDa、11.2 kDa和8.1 kDa，表明酸性多糖AMP40-2相比其它薤白多糖具有較高的相對分子質(zhì)量。
　　 通過氣相色譜分析了各多糖的單糖組成，AMP40-1單糖組成及摩爾比為:阿拉伯糖∶葡萄糖=1.00∶5.03;AMP40-2單糖組成及摩爾比為:鼠李糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.41∶2.34∶1.62∶1.00;AMP60-1單糖組成及摩爾比為:阿拉伯糖∶葡萄糖∶半乳糖=9.73∶1.10∶

10、1.00; AMP80-1單糖組成及摩爾比為:阿拉伯糖∶葡萄糖=1.00∶2.41。結(jié)果表明，AMP40-2相比其它多糖擁有更為復雜的單糖組成。
　　 紅外光譜分析結(jié)果表明: AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1及AMP80-1四種多糖均主要為吡喃糖的糖苷鍵構(gòu)型，且其中AMP40-2既有β-型糖苷鍵，又存在α-型糖苷鍵連接。在1741 cm-1處出現(xiàn)強吸收峰進一步驗證了AMP40-2中的高糖醛酸含量。紫外光譜分析顯示薤

11、白多糖在260-280nm處均未出現(xiàn)明顯的吸收峰，說明薤白多糖不含核酸和蛋白質(zhì)。
　　 薤白多糖樣品(AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1及AMP80-1)通過高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反應、FT-IR、GC/MS以及NMR技術(shù)對其糖苷鍵連接方式、糖鏈分支情況進行分析。結(jié)果表明:AMP40-1中各糖苷主要以β-吡喃糖形式存在，以1，2-葡萄糖殘基和1，2-阿拉伯糖殘基構(gòu)成主鏈，同時以葡萄糖為非還原末端，含有1，

12、2，6-葡萄糖分支的雜多糖;AMP40-2其主鏈主要由Glc(1→6)和Gal(1→6)連接組成，支鏈由Rha(1→2)構(gòu)成，分支點位于Glc(1→6)的C-2處，末端殘基為Glc、Rha及Ara，各糖苷主要以吡喃糖形式存在，且糖苷鍵構(gòu)型存在α型和β型兩種構(gòu)型;AMP60-1主要由Glc(1→2)和Ara(1→5)構(gòu)成主鏈，以Gal(1→6)和Glc(1→6)為支鏈，分支點位于Glc(1→2)的C-6處，末端殘基為Ara，各糖苷主要以β

13、-吡喃糖形式存在;AMP80-1主鏈主要由Glc(1→2)連接組成，支鏈由Glc(1→6)構(gòu)成，分支點位于Glc(1→2)的C-6處，以葡萄糖和阿拉伯糖為非還原末端，各糖苷主要以β-吡喃糖形式存在。同時剛果紅實驗結(jié)果表明薤白多糖AMP40-2具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。
　　 3、薤白多糖體外抗氧化活性及其對小鼠急性肝損傷的保護作用研究通過測定薤白多糖清除1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)的能力、清除羥基自由基(OH·)的能力

14、、清除超氧陰離子自由基(O2·)能力、金屬離子螯合能力和還原能力，分別評價了薤白粗多糖(AMP40、AMP60和AMP80)及其純化組分(AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1和AMP80-1)的體外抗氧化活性，結(jié)果表明:AMP40-2在大多數(shù)抗氧化評價體系中比其它薤白多糖具有更強的抗氧化活性，對比其它薤白多糖表明其較強的抗氧化活性可能與其較高的分子量，較高的糖醛酸含量以及較為復雜的單糖組成有關(guān)。
　　 采用CCl4肝損

15、傷模型評價了薤白多糖(AMP40、AMP60和AMP80)的體內(nèi)抗氧化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過預先灌胃不同劑量的薤白多糖AMP40，可以抑制小鼠化學性急性肝損傷的發(fā)生使肝中毒的各項生化指標趨于正常值，表明薤白多糖AMP40具有一定的肝保護作用。與AMP60及AMP80相比，AMP40在所含多糖分子量大小及糖醛酸含量方面存在明顯差異，這也說明多糖的肝保護作用可能與上述因素密切相關(guān)。
　　 4、薤白多糖抑茵、抑瘤及神經(jīng)營養(yǎng)活性研究采用瓊

16、脂擴散法，對蔥屬植物薤白中薤白水煮部分(AMW)、薤白醇提部分(AWE)和薤白多糖部分(AMP)進行了抑菌活性測定，結(jié)果表明:蔥屬植物薤白具有一定的抗菌活性，其抑菌成分主要存在于醇提部分，可能為揮發(fā)油或其它小分子物質(zhì)，而薤白多糖(水溶性大分子)部分的抗菌活性較弱。
　　 采用MTT法對薤白多糖純化組分(AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1和AMP80-1)在體外抑制人肺癌細胞A549和人胃癌細胞BGC-823的增殖作用

17、進行了研究。結(jié)果顯示，AMP40-1、AMP60-1和AMP80-1三種薤白多糖對人肺癌細胞A549的生長不具有抑制作用，而AMP40-2對人肺癌細胞A549的生長具有一定的抑制作用，且在實驗范圍內(nèi)其抑制作用與濃度呈明顯的濃度依賴效應。對人胃癌細胞BGC-823的增殖實驗結(jié)果表明，薤白多糖均能不同程度的抑制BGC-823細胞的增殖，且抑制作用與多糖之間存在不同程度的正相關(guān)量效關(guān)系和時效關(guān)系。結(jié)果也進一步表明薤白多糖對癌細胞生長抑制作用的