藻酸雙酯鈉的分級制備及其生物活性研究.pdf

1、多糖的生物活性、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及構(gòu)效關(guān)系的研究已成為多糖領(lǐng)域的前沿陣地，并且取得了很大的進(jìn)展。其中，關(guān)于一些相對分子量在幾千以上、強(qiáng)生物活性多糖的研究日益受到重視。 本文以我國自主知識產(chǎn)權(quán)的海洋多糖藥物藻酸雙酯鈉(PSS)作為研究對象，采用超濾及低壓柱層析方法對其分級制備，分離得到具有相似骨架、磺化度及不同相對分子量(M<,w>)的分級產(chǎn)物：通過對各分級產(chǎn)物進(jìn)行抗凝血活性、免疫調(diào)解作用、保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、抗菌、降糖等生物活性的考察

2、，探討PSS的鏈長與活性的關(guān)系，為PSS的廣泛應(yīng)用及多糖構(gòu)效關(guān)系的深入研究進(jìn)行有益的探索。 研究結(jié)果如下： 1、低壓柱層析法以Sephadex G100作為分離介質(zhì)，對PSS(M<,w>：17.19kDa)進(jìn)行分離，高效凝膠滲透色譜法測定產(chǎn)物重均分子量(M<,w>)，得到M<,w>分別為51.95，25.62，11.76，5.41 kDa4個分級產(chǎn)物(Z-PSS：1-4)；以截留分子量分別為30，10，5，3，1 kDa

3、的超濾膜分級PSS，得到M<,w>分別為21.97，20.25，18.27，11.35，4.93，3.33 kDa 6個分級產(chǎn)物(C-PSS：1-6)。氧瓶燃燒法(Oxygen Flask Method)測定所有分級產(chǎn)物磺化度多在1.2-1.3之間；紅外光譜(FT-IR)、核磁共振碳譜(<'13>C-NMR)證明分級產(chǎn)物磺化取代發(fā)生在糖環(huán)的C-2，C-3，酯化取代發(fā)生在C-6。 2、分級產(chǎn)物生物活性比較研究： 2.1、

4、PSS及柱層析分級產(chǎn)物Z-PSS：1-4抗凝血實驗(凝血三項：凝血酶原時間PT，活化部分凝血活酶時間APTT，凝血酶時間TT)顯示：PSS及4個分級產(chǎn)物延長TT時間作用最強(qiáng)，其次為APTT，延長PT時間作用最弱，以上結(jié)果通過與對照組比較，t-test，顯示統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。4個分級產(chǎn)物抗凝活性比較顯示，抗凝血作用與分子量顯著相關(guān)，不同的凝血指標(biāo)對分子量的要求顯著不同，APTT顯著隨PSS分級產(chǎn)物分子量的降低而降低。

5、2.2、PSS及超濾分級產(chǎn)物C-PSS：1-5抗凝血實驗(PT，APTT，TT)進(jìn)一步證實了柱層析分級產(chǎn)物凝血三項實驗結(jié)果：樣品對TT作用最強(qiáng)，APTT次之，對PT作用較弱，而且活性大小與樣品的分子量顯著相關(guān)。 2.3、在凝血三項實驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗證了PSS及柱層析分級產(chǎn)物Z-PSS：1-4對凝血因子FⅡa和FⅩa的作用。結(jié)果顯示PSS主要通過作用于FIIa因子發(fā)揮抗凝血作用，強(qiáng)度與低分子肝素類似；對FⅩa作用較弱。各分級

6、產(chǎn)物抗凝血因子作用比較顯示，作用強(qiáng)度與分子量顯著相關(guān)，隨著分級產(chǎn)物Z-PSS1→4分子量的降低，抗凝血因子作用顯著降低，Z-PSS4失去抗FⅩa作用。 2.4、抗蜂毒肽(Mastoparan)誘導(dǎo)的大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示：PSS對Mastoparan誘導(dǎo)的大鼠子鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有顯著的保護(hù)作用，其分級產(chǎn)物Z-PSS1-3也表現(xiàn)出對凋亡神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用，而Z-PSS4沒有這種作用，證明該作用有最低糖鏈片斷要求，

7、但并不會隨糖鏈長度的延長而保護(hù)作用增強(qiáng)。采用Fluo-3/AM熒光探針技術(shù)標(biāo)記胞內(nèi)鈣離子，測定胞內(nèi)鈣離子濃度變化，推測PSS保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡作用機(jī)制是抑制胞內(nèi)鈣釋放。 2.5、本課題對PSS及Z-PSS1-4的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了細(xì)胞水平的研究。主要考察樣品對小鼠脾臟細(xì)胞、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、刀豆蛋白A(ConcanavalinA，ConA)誘導(dǎo)的免疫T-Cell、脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的B-

8、Cell的作用，探討PSS及分級產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)作用。實驗結(jié)果顯示，PSS能增強(qiáng)脾臟細(xì)胞的增殖作用，抑制Con A誘導(dǎo)的T-Cell和LPS誘導(dǎo)的B-Cell增殖，同時能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。對于脾臟細(xì)胞的作用，PSS分子量在10-20 kDa之間較顯著；對于促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能，顯示PSS分子量最大分級產(chǎn)物作用最強(qiáng)。 2.6、以革蘭氏陽性菌.金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌-大腸桿菌作為目標(biāo)菌株，檢驗PSS及其層析產(chǎn)物Z-PS

9、S：1-4，C-PSS1-5的抑菌作用。結(jié)果顯示：PSS及Z-PSS：1-3，C-PSS1-4對金黃色葡萄球菌有良好的抑制效果，且Z-PSS2-3，C-PSS4效果強(qiáng)于Z-PSS1，C-PSS1-3，證明分子量較小PSS片斷具有較強(qiáng)的抑菌作用；同時Z-PSS4及C-PSS5失去抑菌作用，顯示PSS抑菌活性與糖鏈長度的關(guān)系。 2.7、在胰島細(xì)胞篩選PSS超濾分級產(chǎn)物促進(jìn)胰島素分泌作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)行C-PSS4的降低四氧嘧啶高血糖