粘連分子Paraxial Protocadherin在非洲爪蟾耳基板發(fā)育中的功能研究.pdf

1、脊椎動物的內耳是聽覺的主要功能性器官。在內耳發(fā)育過程中，最早出現的形態(tài)上可見的結構是位于胚胎兩側預定后腦和預定表皮旁的一個增厚的外胚層細胞區(qū)域，即耳基板。耳基板隨后內陷形成一個耳杯，然后它從胚胎表皮脫落形成一個囊泡狀結構稱為聽泡。聽泡細胞經歷了一段強烈的增殖和復雜的細胞分化及形態(tài)發(fā)生時期，最終分化形成內耳的各種細胞。在各種脊椎動物中，已經證明多種信號分子和多個轉錄調控因子等都與內耳的特化和圖式建成有關。但是，還有許多發(fā)育的具體機制目前還

2、不是很清楚。 本論文報道了一個粘連分子cadherin家族的成員ParaxialProtocadherin(PAPC)對于非洲爪蟾聽泡的形成是必需的。原位雜交結果表明，在肉眼可見的耳基板出現以前，PAPC已經特異性地在耳基板的前體細胞中表達。在隨后的內耳發(fā)育過程中PAPC持續(xù)特異性地表達在耳杯，聽泡等內耳細胞中。PAPC的這種表達圖式強烈提示PAPC可能參與爪蟾內耳的早期發(fā)育過程。同時，利用顯性失活質粒DN-PAPC或M-PA

3、PC競爭性地抑制PAPC的功能可導致聽泡結構的缺失和早期內耳特異性標志基因Sox9和Tbx2的表達缺失，而且這一表型能夠被FL-PAPC共注射所拯救回復正常。這些結果都提示PAPC分子對于爪蟾胚胎早期的聽泡的形態(tài)發(fā)生和細胞特化是必需的。同時，研究發(fā)現PAPC異位注射并不足以誘導一個新的異源的耳基板的形成。 為了進一步研究PAPC的蛋白水平的表達及其生物學功能，需要制備PAPC的抗體，但至今沒有商業(yè)化的PAPC抗體，其他文獻也未

4、見相關報道。為此我們應用GST表達系統(tǒng)表達融合蛋白PAPC-GST。然后用常規(guī)方法免疫新西蘭大白兔，獲得PAPC多克隆抗體。Westernblot分析發(fā)現，以1：3000稀釋的該多克隆抗體為一抗時，可以在轉染了全長PAPC(FL-PAPC)質粒的HEK293T細胞的蛋白抽提物中雜交出特異的印跡條帶，PAPC蛋白可以競爭性抑制該抗體對FL-PAPC質粒轉染細胞的蛋白抽提物的特異性條帶。用1：500稀釋的該抗體為一抗進行免疫熒光分析，發(fā)現P