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文檔簡介
1、目的:通過用凋亡阻斷劑zVAD-fmk作為平行對照,來研究程序性壞死特異性阻斷劑Nec-1對鋁致癡呆模型小鼠的神經(jīng)行為改變及其對細(xì)胞死亡方式的影響。
方法:取健康6月齡雄性昆明小鼠120只,分三批,第一批4個劑量組分別為:染鋁對照組(0.5%ALCl3)、2Mm、4mM、8mM Nec-1組;第二批4個劑量組分別為:染鋁對照組、75ng/2μl、150ng/2μl、300ng/2μlzVAD組;第三批4個劑量組分別為:染鋁
2、對照組、4mM Nec-1組、300ng/2μlzVAD組、Nec-1+zVAD組。連續(xù)5天每天1次側(cè)腦室注射上述液體,其中鋁溶液3μl/只/天、Nec-1和zVAD均為2μl/只/天。染毒期結(jié)束后第15天進(jìn)行Morris水迷宮試驗;染毒期結(jié)束后第20天處死小鼠,取腦,切取一半大腦浸泡在10%福爾馬林中固定24h,做病理切片,進(jìn)一步做HE染色、硫堇染色及RIP1的免疫組化;另一半大腦分離出海馬做電鏡,皮層置于EP管中,-70℃保存,用于
3、Western-blot法檢測NF-κB、LC3-II、Caspase3及RIP1的蛋白表達(dá)水平。
結(jié)果:①小鼠學(xué)習(xí)記憶能力測試:在Morris水迷宮實驗中,不同濃度Nec-1作用于染鋁模型小鼠后,與染鋁溶劑對照組相比,在4天的定位航行實驗中,4mM組和8mM組逃避潛伏期顯著縮短(P<0.01),在第5天的空間搜索實驗中,2mM、4mM組和8mM組原平臺象限停留時間顯著延長(P<0.01);不同濃度Z-VAD-FMK作用于
4、染鋁模型小鼠后,與染鋁溶劑對照組相比,在4天的定位航行實驗中,高劑量組逃避潛伏期顯著縮短(P<0.01),在第5天的空間搜索實驗中,低、中、高劑量組原平臺象限停留時間顯著延長(P<0.01);Nec-1、zVAD聯(lián)合作用于染鋁模型小鼠后,與染鋁溶劑對照組相比,在4天的定位航行實驗中Nec-1組和Nec-1+zVAD組逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05),在第5天的空間搜索實驗中Nec-1+zVAD組原平臺象限停留時間顯著延長(P<0.05
5、)。②HE染色及硫堇染色病理組織學(xué)結(jié)果:不同濃度Nec-1、zVAD作用于染鋁模型小鼠大腦皮質(zhì)及海馬CA3區(qū)病理改變顯示:染鋁溶劑對照組小鼠皮質(zhì)區(qū)可見核周及胞漿空泡變性、個別細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞以及細(xì)胞輪廓模糊,海馬區(qū)細(xì)胞數(shù)量少,出現(xiàn)細(xì)胞連接松解,細(xì)胞核固縮等,部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死表現(xiàn),胞核聚集、濃縮、溶解等,在顆粒層中可見零星輕微損傷細(xì)胞,主要表現(xiàn)為細(xì)胞核被染為深藍(lán)色、胞漿深紅色,出現(xiàn)核周輕度空泡變性,隨著Nec-1、zVAD劑量的升高,上述形態(tài)
6、學(xué)改變逐漸減弱;Nec-1、zVAD聯(lián)合作用于染鋁模型小鼠大腦皮質(zhì)及海馬CA3區(qū)病理改變顯示:Nec-1組和zVAD組上述形態(tài)學(xué)改變有所緩解,Nec-1+zVAD組少見細(xì)胞形態(tài)異常,且細(xì)胞數(shù)量明顯增多,排列也較規(guī)則。③死亡相關(guān)蛋白的檢測:Western blot法檢測不同濃度Nec-1作用于染鋁模型小鼠后其大腦皮質(zhì)內(nèi)caspase3的蛋白表達(dá)呈下降趨勢,中、高劑量組caspase-3的蛋白表達(dá)較對照組顯著降低,且差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<O
7、.01);LC3-II的蛋白表達(dá)也呈下降趨勢,且低、中、高劑量組較對照組顯著降低,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<O.01);NF-κB的蛋白表達(dá)也基本呈下降趨勢,但差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>O.05);RIP的蛋白表達(dá)也基本呈下降趨勢,且中劑量組較對照組顯著降低,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<O.05)。不同濃度zVAD.fmk作用于染鋁模型小鼠,Western-blot法檢測其大腦皮質(zhì)內(nèi)caspase3的蛋白表達(dá)呈下降趨勢,高劑量組caspase3的蛋白
8、表達(dá)較對照組顯著降低,且差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<O.01),LC3-II的蛋白表達(dá)呈增加趨勢,且中、高劑量組較對照組顯著增加,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<O.01),NF-κB的蛋白表達(dá)呈下降趨勢,且低、中、高劑量組較對照組顯著降低,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<O.01),RIP1的蛋白表達(dá)呈增加趨勢,且中、高劑量組較對照組顯著增加,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<O.01)。Nec-1、zVAD聯(lián)合作用于染鋁模型小鼠,Western-blot法檢測其大腦皮質(zhì)
9、內(nèi)caspase3的蛋白表達(dá)呈下降趨勢,且Nec-1組、zVAD組及Nec-1+zVAD組的caspase3的蛋白表達(dá)較對照組顯著降低,且差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<O.01),LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)Nec-1組較溶劑對照組有降低趨勢,zVAD組較對照組則增加趨勢,Nec-1+zVAD組較對照有增加趨勢,但均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>O.05),但zVAD組較Nec-1組的升高有統(tǒng)計學(xué)差異(P<O.05),NF-κB的蛋白表達(dá)Nec-1、zVAD組較溶
10、劑對照組有增加趨勢,且差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<O.01),zVAD組較Nec-1組則呈降低趨勢,且差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<O.01),Nec-1+zVAD組較對照有降低趨勢,差別有統(tǒng)計學(xué)差異(P<O.05),RIP1的蛋白表達(dá)Nec-1組較溶劑對照組有降低趨勢,且差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<O.01),zVAD組較對照組則增加趨勢,且差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<O.01),Nec-1+zVAD組較對照有降低趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>O.05)。
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