外源性VEGF對腦缺血模型大鼠認(rèn)知能力的保護(hù)作用及機(jī)制探究.pdf

1、目的:
　　(1)通過在體(in vivo)實(shí)驗(yàn)觀察外源性血管內(nèi)皮生長因子VEGF對慢性低灌注型腦缺血模型大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用及電生理學(xué)和組織學(xué)機(jī)制。
　　(2)利用離體（in vitro）海馬腦片缺血缺氧模型探討VEGF對海馬神經(jīng)元保護(hù)作用的細(xì)胞學(xué)及電生理學(xué)機(jī)制。
　　方法:
　　(1)In vivo:將30只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成3組，每組10只:假手術(shù)組（Sham）、缺血組(Ischemia)、VE

2、GF處理組(Ischemia+VEGF)。采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(2-VO)2周建立慢性低灌注型腦缺血大鼠模型。采用鼻飼法給予外源性VEGF，然后利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(MWM)比較各組大鼠的空間認(rèn)知功能;行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)，內(nèi)容包括海馬CA3-CA1區(qū)的長時程增強(qiáng)LTP以及局部場電位(LFP)，并應(yīng)用神經(jīng)信息流算法分析各組大鼠CA3與CA1區(qū)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的振蕩模態(tài)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取腦，使用ELISA的方法測定各組海馬內(nèi)VEG

3、F的含量并通過組織學(xué)方法(HE染色)觀察海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　(2) In vitro:首先利用糖氧剝奪(OGD)的方法建立離體缺血缺氧海馬腦片模型，實(shí)驗(yàn)分為4組，即正常組(Control)、糖氧剝奪組(OGD)、VEGF處理組(OGD+VEGF)、VEGF及其受體抑制劑處理組(OGD+VEGF+SU5416)。使用碘化丙啶(PI)染色的方法并利用共聚焦顯微鏡觀察各組腦片海馬CA1區(qū)神經(jīng)元在OGD處理20 min后

4、的存活情況。然后分別記錄各組腦片在OGD處理10 min以及恢復(fù)正常腦脊液后的電生理信號的變化，包括神經(jīng)元膜電位、自發(fā)放電頻率以及sEPSCs的變化。
　　結(jié)果:
　　(1)水迷宮(MWM)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血組大鼠的逃避潛伏期從訓(xùn)練的第3天開始比假手術(shù)組顯著延長(Ischemia:13.5±1.9svs.Sham:8.1±1.2 s，P＜0.05)，而VEGF處理后的腦缺血大鼠的逃避潛伏期也從第3天開始比缺血組大鼠明顯地縮短

5、了(Ischemia+VEGF:8.5±1.1s，P＜0.05 vs.Ischemia);但是，三組大鼠的平均游泳速度無顯著性差別(P＞0.05)。測試日的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺血組大鼠在目標(biāo)象限停留的百分比比假手術(shù)組的大鼠明顯減少（Ischemia:34.2±1.6％ vs.Sham:42.9±1.5％，P＜0.05），VEGF處理后缺血大鼠的目標(biāo)象限百分比幾乎恢復(fù)到假手術(shù)組的水平(Ischemia+ VEGF:40.1±2.6％)。
　

6、　(2)記錄并分析各組大鼠海馬CA3-CA1通路的長時程增強(qiáng)LTP的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血組的場興奮性突觸后電位(fEPSPs)斜率百分比比假手術(shù)組顯著降低(Ischemia:117.8±6.23％ vs.Sham:136.2±5.96％，P＜0.01)，而VEGF組則比缺血組明顯要高(130.6±5.36％，P＜0.01 vs.Ischemia)。
　　(3)記錄并計算各組大鼠海馬CA3與CA1區(qū)局部場電位(LFP)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血能

7、夠引起海馬CA3與CA1腦區(qū)間的相位同步性降低，CA3區(qū)theta相位調(diào)控CA1低頻gamma(LG,30-60Hz)幅值的程度顯著降低，而加入VEGF后，CA3、CA1腦區(qū)間的耦合強(qiáng)度均有上升的趨勢。
　　(4) HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元形態(tài)正常。而缺血組的CA1神經(jīng)元排列松散，分布不均，細(xì)胞出現(xiàn)水腫以及核固縮的現(xiàn)象。而VEGF處理組大鼠的CA1神經(jīng)元可見部分形態(tài)正常，部分形態(tài)異常，分布及排列趨近于正

8、常組。
　　(5)分析各組大鼠海馬內(nèi)VEGF的含量發(fā)現(xiàn)，缺血組大鼠海馬內(nèi)的VEGF含量明顯比假手術(shù)組要低（Sham:745.33±42.34 pg/g vs.Ischemia:420.09±40.82Pg/g，P＜0.01），而VEGF處理組的海馬內(nèi)的VEGF含量有顯著提高(592.83±38.76 pg/g，P＜0.05 vs.Ischemia)，但仍然低于假手術(shù)組（P＜0.05）。
　　(6)在離體實(shí)驗(yàn)中檢測各組腦片海馬

9、CA1神經(jīng)元存活情況的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OGD處理20 min后，神經(jīng)元的死亡率顯著上升(Control vs.OGD，P＜0.05)，而VEGF孵育組存活細(xì)胞的數(shù)量增多，接近正常組。然而與VEGFR-2的抑制劑SU5416共孵育之后，神經(jīng)元的死亡率升高，接近OGD組。
　　(7)膜片鉗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OGD處理后CA1神經(jīng)元的電生理特性能夠發(fā)生可逆性變化的時間窗口為10 min，在恢復(fù)正常aCSF處理后絕大部分神經(jīng)元的膜電位能夠恢復(fù)正常，因此

10、將其確定為本實(shí)驗(yàn)的時間窗口。
　　(8)在10 min OGD處理期間分析各組神經(jīng)元的興奮性發(fā)現(xiàn)，OGD組神經(jīng)元的膜電位在OGD結(jié)束時去極化了14.7±1.23 mV(n=5)，而VEGF處理組神經(jīng)元則去極化了6.1±1.57mV(n=8，OGD vs.OGD+VEGF,P＜0.01)。同時共孵育VEGFR-2抑制劑SU5416組(OGD+VEGF+SU5416)則去極化了12.1±1.92 mV(n=6）。同樣的在自發(fā)放電頻率的

11、統(tǒng)計結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，OGD+VEGF組的神經(jīng)元的在OGD期間的自發(fā)放電頻率比base時增加了5.1±0.6倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于OGD組（9.2±0.56倍，P＜0.01，n=5），而OGD+VEGF+SU5416放電頻率增加了8.1±0.47倍，高于VEGF處理組且具有顯著差異（P＜0.01，n=5），但是與OGD組相比卻不具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(9)在記錄并分析了各組大鼠海馬CA1神經(jīng)元的sEPSCs事件結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在10mi

12、n OGD處理期間，各組sEPSCs的幅值和頻率均時間依賴性的增加，而在VEGF處理組，這兩個指標(biāo)增加的程度被緩解，但仍不能恢復(fù)到正常水平。而加入VEGF受體抑制劑SU5416之后，VEGF的緩解效果被解除，說明VEGF的作用是通過VEGFR-2受體發(fā)揮作用的。
　　結(jié)論:
　　(1)外源性給予VEGF可顯著改善VD大鼠的空間認(rèn)知障礙，其機(jī)制包括改善缺血大鼠海馬錐體神經(jīng)元水腫和核固縮情況，維持海馬神經(jīng)元正常功能。
　　

13、(2)通過鼻飼法給予外源性VEGF是一種可行的方法，可以使缺血大鼠海馬內(nèi)VEGF的含量有效升高，對缺血產(chǎn)生了保護(hù)作用。
　　(3) VEGF能夠改善VD大鼠海馬內(nèi)突觸可塑性的降低，增強(qiáng)CA3-CA1的長時程增強(qiáng)LTP，這一現(xiàn)象可能與VEGF改善了它們之間theta節(jié)律與gamma節(jié)律的交叉耦合模式有關(guān)。
　　(4)在離體缺血缺氧腦片模型中，外源性VEGF能夠通過其VEGFR-2受體來發(fā)揮對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用，其機(jī)制是對抗缺