胎盤鈣化組織中納米細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定及其相關(guān)蛋白的初步分析.pdf

1、第一部分:胎盤鈣化組織中納米細(xì)菌的分離與培養(yǎng)
　　背景：芬蘭科學(xué)家Kajander教授及其團(tuán)隊(duì)最早從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的空泡樣變化，在排除了一切可能的微生物污染的情況下對其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一種可以自我復(fù)制礦化且直徑只有50-800nm的微生物，命名為納米細(xì)菌(Nanobacteria NB)并申請了專利。利用傅里葉變換色散光譜分析(FTIR)表明納米細(xì)菌外殼的主要成分為羥磷灰石，所以又稱為納米礦化顆粒(CNPs)。有科學(xué)

2、家在透射電鏡下觀察早期鈣化胎盤組織發(fā)現(xiàn)納米礦化顆粒的存在，但未能分離培養(yǎng)出納米細(xì)菌。
　　目的：從胎盤鈣化組織和相應(yīng)胎兒臍帶血中分離培養(yǎng)出與鈣化相關(guān)的納米細(xì)菌，觀察其生長特性，探討胎盤鈣化發(fā)生的微生物感染證據(jù)以及胎盤鈣化與胎兒納米細(xì)菌感染的關(guān)系。
　　方法：以臨床所取36份胎盤鈣化組織作為研究對象，透射電鏡觀察鈣化組織中的納米細(xì)菌。而后依次利用1mol/L鹽酸脫礦，Tris中和，生理鹽水稀釋，14，000g高速離心，最后通過

3、0.22μm細(xì)菌濾器過濾的方法進(jìn)行分離。濾液過濾到有棉塞試管中，加入含有10％胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，調(diào)整pH7.4，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱5％CO2，95％空氣條件下培養(yǎng)。觀察細(xì)菌生長情況并依據(jù)沉淀類型分類。OD650波長下記錄納米細(xì)菌菌液相對濃度OD值，制作生長曲線。胎牛血清(FBS)和生理鹽水作為試劑對照，無鈣化的正常胎盤組織作為實(shí)驗(yàn)對照，用RPMI1640培養(yǎng)基作為空白對照。同時(shí)對存在胎盤鈣化的胎兒取臍帶血，對納米細(xì)

4、菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，方法同上。
　　結(jié)果：透射電鏡下觀察鈣化胎盤組織標(biāo)本，可見胎盤絨毛組織和鈣化斑塊之間存在橢圓形納米顆粒，其直徑約為50-500nm，每個(gè)顆粒都被具有不同電子密度的薄外殼包圍，其中有些顆?？梢姺至?，與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道相似。實(shí)驗(yàn)組中有28例可見白色沉淀完全或部分粘附在試管底部，對照組未見沉淀產(chǎn)生，差異具有顯著性(P<0.01)。OD650分光光度計(jì)下記錄得到納米顆粒生長曲線與其他細(xì)菌類似。臍帶血分離培養(yǎng)的結(jié)果與相應(yīng)鈣化組

5、織胎盤中納米細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果正相關(guān)，有12例實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)物可見白色沉淀物，對照組未見(P<0.01)。
　　結(jié)論：通過納米細(xì)菌分離培養(yǎng)的方法可以從鈣化胎盤組織中得到具有自我復(fù)制礦化功能的納米顆粒，且存在胎盤鈣化的胎兒也較易感染此納米顆粒。
　　第二部分:鈣化胎盤組織中納米細(xì)菌的鑒定
　　背景：進(jìn)一步對培養(yǎng)所得白色沉淀物進(jìn)行形態(tài)學(xué)和基因組學(xué)的鑒定。由于納米細(xì)菌形態(tài)微小，有的還不足100nm，因此許多科學(xué)家認(rèn)為它并不存在遺傳基

6、因，也不屬于生物范疇。Kaiander教授向GenBank中提交了納米細(xì)菌特異的16SrRNA基因序列X98418，因此后續(xù)科學(xué)家多依據(jù)這個(gè)序列對分離培養(yǎng)出的納米細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定。
　　目的：利用透射電鏡，掃描電鏡，茜素紅染色和16SrRNA基因分析的方法對分離培養(yǎng)得到的納米細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。
　　方法：①透射電鏡觀察：納米細(xì)菌14，000g高速離心沉淀，戊二醛前固定，四氧化二鋨后固定，梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制作超薄切片

7、，雙重電子染色，雙蒸水洗滌，干燥后在透射電鏡下觀察拍照。②掃描電鏡觀察：納米細(xì)菌沉淀利用戊二醛固定，常規(guī)脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金，在掃描電鏡下觀察拍照。③茜素紅染色：培養(yǎng)標(biāo)本涂片固定，沖洗，2％茜素紅染液染，0.2％淡綠水溶液復(fù)染，0.5％醋酸水溶液沖洗，乙醇脫水，烘干后用中性樹膠封片，高倍鏡下觀察拍照。④16SrRNA基因序列分析：提取納米細(xì)菌基因組，設(shè)計(jì)納米細(xì)菌16SrRNA基因序列特異性引物，PCR擴(kuò)增其特異性序列，凝膠電泳觀察并回

8、收目的片段，送檢進(jìn)行基因序列分析，結(jié)果與GenBank比對。根據(jù)比對結(jié)果設(shè)計(jì)新發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌16SrRNA基因特異性引物，對胎盤鈣化組織進(jìn)行16SrRNA基因序列分析，其結(jié)果與新發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌進(jìn)行比對，驗(yàn)證提取過程有無污染菌。再將所得菌株與GenBank中所收錄納米細(xì)菌相關(guān)16SrRNA基因做系統(tǒng)進(jìn)化分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。
　　結(jié)果：①透射電鏡下可見菌液中的納米細(xì)菌呈橢圓形，直徑在200-500nm，有或沒有高電子密度的外殼包繞在外。

9、②掃描電鏡下可見納米細(xì)菌形態(tài)微小，單個(gè)顆粒直徑在200nm左右，或聚集成微米大小團(tuán)塊。⑧茜素紅染色可見納米細(xì)菌染成紅色細(xì)小顆粒。④16SrRNA基因分析發(fā)現(xiàn)胎盤鈣化組織中分離培養(yǎng)得到納米細(xì)菌新種屬，分別與納米細(xì)菌X98418相比有93％和81％相似性，兩個(gè)種屬納米細(xì)菌的16SrRNA基因測序結(jié)果提交GenBank得到基因編號JN029830與JF823648。鈣化胎盤組織中納米細(xì)菌基因擴(kuò)增分析可知其與先前分離培養(yǎng)菌液中的納米細(xì)菌是同一種

10、菌。與GenBank中其他納米細(xì)菌種屬進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)種屬的納米細(xì)菌與先期Kajander教授提交的Nanobacterium sanguineum(X98418)親緣關(guān)系最近。
　　結(jié)論：胎盤鈣化組織中分離培養(yǎng)得到的納米細(xì)菌是兩個(gè)新的納米細(xì)菌種屬，與前期Kajander教授提交的Nanobacterium sanguineum具有較近的親緣關(guān)系。
　　第三部分:鈣化胎盤中納米細(xì)菌的感染與鈣化相關(guān)蛋白分泌關(guān)系的初步探討<

11、br>　　背景：納米細(xì)菌誘導(dǎo)鈣化形成的機(jī)制還不明確，也沒有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究證明它可以促進(jìn)鈣化相關(guān)蛋白的分泌。由于納米細(xì)菌的主要成分是羥基磷灰石，而這種成分被證實(shí)可以促使骨骼形成同時(shí)促進(jìn)鈣化相關(guān)蛋白的分泌。因此，作者初步分析鈣化相關(guān)蛋白-骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein BMP-2)與骨橋蛋白(Osteopontin OPN)在鈣化胎盤組織中的分泌以及與納米細(xì)菌感染之間的關(guān)系。
　　目的：探討納米細(xì)

12、菌感染對胎盤組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)與骨橋蛋白(OPN)兩種鈣化相關(guān)蛋白分泌的影響。
　　方法：分別取鈣化胎盤組織納米細(xì)菌分離培養(yǎng)陽性組，陰性組以及正常胎盤組的胎盤組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)對象。①免疫組化的方法分析不同實(shí)驗(yàn)組織BMP-2與OPN兩種蛋白表達(dá)的差異：制作組織切片，HE染色，觀察鈣化。常規(guī)脫蠟水化，血清封閉，分別孵育BMP-2和OPN蛋白單克隆抗體4℃過夜，生物素化二抗作用，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察拍照

13、。②Western Blot：SDS-PAGE電泳的方法分離出鈣化與非鈣化組織中BMP-2與OPN兩種蛋白，化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，軟件半定量分析目的條帶的灰度值，比較BMP-2與OPN兩種鈣化相關(guān)蛋白在不同組織中的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：免疫組化結(jié)果可見鈣化胎盤組織中納米細(xì)菌分離培養(yǎng)陽性組與陰性組BMP-2與OPN的表達(dá)均高于正常胎盤組織(P<0.01)。Western Blot結(jié)果分析可知BMP-2與OPN在鈣化胎盤組織中納米細(xì)菌

14、分離陽性組和陰性組的表達(dá)高于正常胎盤組織(P<0.01)。但兩組之間表達(dá)差異不明顯(P>0.05)
　　結(jié)論：鈣化組織BMP-2與OPN兩種蛋白的表達(dá)確有增加，但納米細(xì)菌感染對于促進(jìn)胎盤組織的鈣化機(jī)制仍不明確。
　　第四部分:納米細(xì)菌分離培養(yǎng)與保存的方法研究
　　背景：納米細(xì)菌的特殊組成成分、大小和復(fù)制方式使得其分離培養(yǎng)與保存方法一直沒有統(tǒng)一。為了使更多疑似與納米細(xì)菌感染有關(guān)的疾病可以分離培養(yǎng)出納米細(xì)菌，作者以胎盤鈣化

15、組織為例，探討鈣化組織中納米細(xì)菌的分離技術(shù)。同時(shí)，通過對納米細(xì)菌不同的培養(yǎng)和保存條件的實(shí)驗(yàn)研究，來探討納米細(xì)菌的培養(yǎng)與保存的最佳條件和方法，有助于納米細(xì)菌的陽性培養(yǎng)和后續(xù)基因組計(jì)劃的實(shí)施。
　　目的：以鈣化的胎盤組織為例，尋求在鈣化組織中分離納米細(xì)菌的最佳方法，探究培養(yǎng)和保存納米細(xì)菌最適宜的方法和條件。
　　方法：方法①胎盤鈣化組織標(biāo)本分別用鹽酸脫礦與超聲振蕩脫礦的方法分離納米細(xì)菌，計(jì)算其分離陽性率。②分離出的納米細(xì)菌分別用

16、細(xì)胞培養(yǎng)箱與細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)4周，利用分光光度計(jì)記錄兩種條件下納米細(xì)菌濃度的變化，并描繪生長曲線。③分別用4℃，-20℃與-80℃冰箱保存鈣化組織和納米細(xì)菌，記錄納米細(xì)菌分離和復(fù)蘇的生長狀況并繪制生長曲線。
　　結(jié)果：①鈣化組織用鹽酸脫礦更易分離得到納米細(xì)菌。②細(xì)胞與細(xì)菌培養(yǎng)環(huán)境下納米細(xì)菌的生長速度并無明顯差別。③4℃保存鈣化組織和納米細(xì)菌菌液對于其分離和復(fù)蘇都要優(yōu)于-20℃和-80℃
　　結(jié)論：對鈣化組織進(jìn)行鹽酸脫礦可以更好