基于TMT技術(shù)的關(guān)于彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、背景及目的：彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥(Diffuse Idiopathic Skeletal Hyperostosis,DISH),也稱為彌漫性特發(fā)性骨肥大,是一類肌腱附著點(diǎn)炎及相應(yīng)的韌帶出現(xiàn)骨化、鈣化及在骨骼附著部有新骨形成為主要表現(xiàn)的骨病,主要涉及的多發(fā)部位包括脊柱、骨盆,另外常常侵犯跟骨、髕骨等處。DISH的診斷目前仍為影像學(xué)診斷,雖然由于不同作者根據(jù)不同的的骨橋形成情況而納入的標(biāo)準(zhǔn)不同,其報(bào)道的患病率也各不相同,但總體發(fā)病率均隨著年

2、齡的增長(zhǎng)而持續(xù)性地增高。由于本病的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確,因此本病的診斷手段仍然停留在影像學(xué)檢查這一單一方式上,但DISH早期的影像學(xué)表現(xiàn)有可能并不突出,未必能夠引起足夠的重視從而造成漏診。本研究是通過(guò)差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,采用蛋白標(biāo)簽定量技術(shù)(Tandem Mass Tag,TMT)、聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid Chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析,對(duì)DISH患者

3、的血清中存在的相對(duì)于正常人的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選和鑒定,結(jié)合蛋白質(zhì)功能的生物信息網(wǎng)絡(luò)等研究成果,對(duì)所鑒定的蛋白質(zhì)在DISH發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行分析研究。以期尋找DISH發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)的特異差異蛋白,為臨床篩查和診斷DISH提供某種血清蛋白標(biāo)記物,并為進(jìn)一步研究DISH的發(fā)病機(jī)理、尋找診斷及藥物治療靶點(diǎn)、疾病預(yù)后判斷甚至易感人群的判定等提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：1)根據(jù)特異度較高的Resnick關(guān)于DISH的診斷標(biāo)準(zhǔn),采集1

4、0例彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥(DISH)患者,以及10例年齡相近、性別匹配的正常人(經(jīng)影像學(xué)檢查排除DISH等異常骨質(zhì)增生的情況)的空腹靜脈血。經(jīng)低溫離心后獲取血清分裝標(biāo)識(shí),并于-80℃條件保存。所有血清經(jīng)過(guò)去除高峰度蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳),然后進(jìn)行蛋白膠內(nèi)酶解,用胰蛋白酶(Trypsin)消化蛋白得到肽段。用TMT進(jìn)行標(biāo)記,TMT6-127用于標(biāo)記對(duì)照組,TMT6-131用于標(biāo)記DISH組。將標(biāo)記好

5、的肽段混合后經(jīng)過(guò)除鹽除雜質(zhì)處理,通過(guò)Dionex Ultimate 3000納升液相色譜儀聯(lián)合Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)分析。數(shù)據(jù)用Xcalibur 2.1.2 software進(jìn)行分析。搜庫(kù)軟件為Proteome Discoverer,采用SEQUEST HT檢索算法,譜圖檢索Swissprot Human數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)不同TMT試劑報(bào)告離子的相對(duì)豐度來(lái)進(jìn)行肽段相對(duì)定量,并根據(jù)肽段相對(duì)定量結(jié)果統(tǒng)計(jì)出蛋白的相對(duì)定量

6、結(jié)果。同一蛋白在某一組相對(duì)于另一組的比值(Ratio),認(rèn)為確定比值變化超過(guò)1.3倍,即大于1.3為上調(diào),小于0.75為下調(diào),被認(rèn)為有顯著性差異,而其它肽段離子用來(lái)做蛋白鑒定。2)將鑒定出的所有差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)差異蛋白在生物網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)系,進(jìn)一步篩選認(rèn)為有意義的蛋白。
　　結(jié)果：共找到425個(gè)蛋白,score大于5的有253個(gè),有定量信息的蛋白185個(gè),其中,上調(diào)大于1.3倍的17個(gè),下調(diào)小于0.75倍的56個(gè);sc

7、ore大于5分并且沒(méi)有定量信息的蛋白有68個(gè),發(fā)現(xiàn)其中Ig alpha-2 chain C region和Isoform H14of Myeloperoxidase(MPO)這兩個(gè)蛋白只在DISH病人血清中存在。對(duì)能夠定量的蛋白進(jìn)行生信分析,發(fā)現(xiàn)在下調(diào)蛋白中有15個(gè)蛋白都參與到對(duì)刺激的響應(yīng)中,包括extracellular superoxide dismutase[Cu-Zn](細(xì)胞外過(guò)氧化物歧化酶)和蛋白glutathione per

8、oxidase(谷胱甘肽過(guò)氧化物酶,GPx3)。在下調(diào)蛋白中,通過(guò)KEGG信號(hào)通路分析,可以看到參與PPAR信號(hào)通路的三個(gè)蛋白PLTP、APO-AI和APO-AII都有明顯的下調(diào)。通過(guò)生物信息學(xué)分析推斷認(rèn)為DISH患者可能參與脂蛋白代謝的PPAR通路受到影響,從而導(dǎo)致了處于該通路上下游的MPO、PLTP、APO-AI和APO-AII出現(xiàn)變化。
　　結(jié)論：1、本研究是首次采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽蛋白定量技術(shù)、聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析,對(duì)DI

9、SH患者的血清進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究。摸索并確立了DISH患者血清TMT-LC-MS/MS實(shí)驗(yàn)研究的技術(shù)路線。2、對(duì)DISH的特異血清標(biāo)記物和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了初步的探索,建立了DISH患者的血清差異蛋白質(zhì)組資料庫(kù)。發(fā)現(xiàn)了DISH患者血清中相對(duì)于正常人具有顯著變化的可定量蛋白、以及幾種DISH患者血清中獨(dú)有的無(wú)定量信息蛋白。3、通過(guò)本次研究,我們?cè)谕ㄟ^(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)上對(duì)所篩選的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,通過(guò)分析在同一信號(hào)通路中出現(xiàn)的多種