彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥患者與正常人群血清miRNAs的對(duì)比研究.pdf

1、研究背景:
　　彌漫性特發(fā)性骨質(zhì)增生癥（diffuse idiopathic skeletal hyperostosis，DISH）是一種主要累及脊柱尤其是胸椎，并影響韌帶的脊柱退行性疾病。本病的病因未明，雖有家族發(fā)病的報(bào)道但少見(jiàn)，越來(lái)越多的資料顯示骨代謝異常為本病的易患因素。
　　miRNA(microRNA)是一些長(zhǎng)度很短的非編碼RNA，通過(guò)降低靶基因的穩(wěn)定性或抑制其翻譯水平來(lái)影響細(xì)胞的分化、增殖和凋亡。骨組織的發(fā)生、生

2、長(zhǎng)、代謝同樣與miRNA有著密切的關(guān)聯(lián)。與骨代謝相關(guān)的miRNA的表達(dá)水平變化都會(huì)引起骨質(zhì)代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等骨疾病的發(fā)生。
　　miRNA分子廣泛存在于正常人和不同種病人的血清和血漿中，并且隨著生理狀況、疾病的種類和病程的不同，miRNA分子在血清和血漿中存在的種類和數(shù)量將發(fā)生變化。差異表達(dá)的特異miRNA與疾病導(dǎo)致的異常代謝機(jī)制有關(guān)，因此，檢測(cè)循環(huán)中的miRNA為疾病的診斷以及治療提供潛在可能。
　　DISH作為

3、一種全身性疾病，其患者的骨密度較正常人增高，提示可能有相應(yīng)的骨代謝異常參與疾病的發(fā)生。本研究首次通過(guò)檢測(cè)DISH患者血清中與健康人群比較差異表達(dá)的miRNA，推測(cè)判斷其在DISH發(fā)病機(jī)制中的作用，為DISH的血清水平的診斷、發(fā)病機(jī)制的研究及治療提供新的思路。
　　目的:
　　1.利用miRNA微陣列芯片技術(shù)篩選DISH患者與正常對(duì)照組間血清共同差異miRNAs。
　　2.篩選DISH相關(guān)的miRNAs，利用生物信息學(xué)技

4、術(shù)分析差異miRNA作用的靶基因，以及其與骨代謝相關(guān)信號(hào)通路，探討其在DISH疾病中的發(fā)生、進(jìn)展中作用，為探明miRNAs在調(diào)控DISH發(fā)生的機(jī)制方面提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，探索miRNA在DISH診斷、干預(yù)治療的臨床意義。
　　方法:
　　1.選擇新確診的DISH患者3例，健康志愿者3名作為研究對(duì)象。分別收集血清后，提取血清中總RNA。經(jīng)質(zhì)控檢驗(yàn)合格后，利用miRNA微陣列芯片技術(shù)對(duì)DISH患者與健康對(duì)照組之間差異表達(dá)的m

5、iRNA進(jìn)行篩選。篩選差異表達(dá)的miRNA的標(biāo)準(zhǔn)為:3例患者共同上調(diào)的Foldchange值＞2，P＜0.05;下調(diào)的Foldchange值＜2，P＜0.05。
　　2.通過(guò)查詢miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異的miRNA進(jìn)行序列分析;通過(guò)查詢Microcosm，Miranda和TargetScan三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)合目前已有DISH病因?qū)W研究成果，選取可能的目標(biāo)miRNA。并對(duì)miRNA可能起作用的細(xì)胞間信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)。<

6、br>　　結(jié)果:
　　1.標(biāo)本經(jīng)質(zhì)控確認(rèn)合格后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行miRNA篩選。DISH患者血清同健康對(duì)照組比較，上調(diào)的miRNA有7個(gè)，分別為hsa-let-7f-1-3p，hsa-miR-223-3p，hsa-miRPlus-C1076, hsa-miR-296-5p, hsa-miR-4664-3p, hsa-miR-4667-3p及hsa-4miR-4783-3p。下調(diào)的有2個(gè)，分別為hsa-miR-1469，hsa-miR-

7、3646。
　　2.根據(jù)目前已知的DISH研究資料，同時(shí)根據(jù)對(duì)每個(gè)miRNA靶基因的預(yù)測(cè)，篩選出可能的共同差異表達(dá)的miRNA。上調(diào)的miRNA中選擇hsa-let-7f-1-3p，hsa-miR-223-3p, hsa-miR-296-5p。
　　3.篩選出的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，DISH患者血清中差異表達(dá)的miRNA可能與DISH相關(guān)的主要靶基因包括TGFBR1，ID1，ID4，BMPR2，SRF，JAG1，SMAD

8、1等，這些靶基因涉及成骨細(xì)胞分化生長(zhǎng)的多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路，如BMP信號(hào)通路，Wnt信號(hào)通路，Notch信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路，TGF-beta信號(hào)通路等。提示這些miRNA可能參與DISH成骨骨化的發(fā)病機(jī)制。
　　結(jié)論:
　　1本研究通過(guò)對(duì)DISH患者進(jìn)行血清miRNA研究，初步發(fā)現(xiàn)DISH患者的血清miRNA與健康對(duì)照組存在差異，并成功構(gòu)建了DISH患者與健康對(duì)照組患者血清差異miRNA資料庫(kù);
　　2利用生物信息