大鼠乙酸性胃潰瘍及維胃方治療的代謝組學(xué)研究.pdf

1、背景：
　　 胃潰瘍病(Gastric Ulcer,GU)是常見的消化系統(tǒng)疾病,由胃液對(duì)胃黏膜自身消化所形成的潰瘍樣病變。GU發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病是致潰瘍的攻擊因子與保護(hù)胃黏膜的防御因子失衡所致。其主要病因包括:胃酸與胃蛋白酶作用,幽門螺桿菌(H.pylori,Hp)感染,非甾體抗炎藥(NSAID)使用,胃十二指腸動(dòng)力異常,應(yīng)激及遺傳因素影響等,其中胃酸、蛋白酶、Hp對(duì)GU的發(fā)病起主導(dǎo)作用。近年來,由于組胺-2受體拮抗

2、劑(H2RA)、質(zhì)子泵抑制劑(PPI)與Hp根除方案的廣泛使用,GU容易達(dá)到近期治愈效果,但停藥后其復(fù)發(fā)率高,這與潰瘍愈合質(zhì)量(QOUH)不高有關(guān)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為胃潰瘍屬“胃脘痛”范疇,其發(fā)生與情緒、飲食所傷、脾胃虛弱等密切相關(guān)。中醫(yī)治療GU重在辨證施治,通過中藥的綜合作用機(jī)制,顯著提高胃潰瘍的QOUH,降低潰瘍復(fù)發(fā)率。
　　 維胃方(WWF)是臨床治療胃潰瘍的經(jīng)驗(yàn)方。前期的實(shí)驗(yàn)研究表明,維胃方可調(diào)節(jié)乙酸性胃潰瘍大鼠血清胃泌素(GA

3、S)、血漿神經(jīng)降壓素(NT)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、白介素-2(IL-2)、一氧化氮(NO)的水平及誘生型一氧化氮合酶(iNOS)的活性,提高胃黏膜中氨基己糖的含量,從而減輕胃黏膜損傷,增強(qiáng)胃黏膜屏障,有效促進(jìn)胃潰瘍愈合。
　　 大鼠乙酸性胃潰瘍模型是經(jīng)典的胃潰瘍模型,其自愈時(shí)間長(zhǎng)且愈合后容易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)及其病理特征與人類慢性胃潰瘍的特點(diǎn)十分相似,現(xiàn)已廣泛用于抗?jié)兯幬锏乃幮c作用機(jī)制研究,但該模型的發(fā)生與自愈機(jī)制仍不甚明確。另

4、外,運(yùn)用該模型評(píng)價(jià)抗胃潰瘍中藥時(shí),往往選擇單一指標(biāo)或若干個(gè)指標(biāo)進(jìn)行,不能系統(tǒng)反映中藥多靶點(diǎn)綜合作用的特點(diǎn)。
　　 代謝組學(xué)(Metabonomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后的一種新的生物組學(xué)技術(shù)。它運(yùn)用系統(tǒng)研究手段,分析生物體受病理生理或基因變異等刺激或藥物作用后,其整體內(nèi)源性小分子代謝物質(zhì)的動(dòng)態(tài)應(yīng)答變化；再運(yùn)用模式識(shí)別技術(shù),尋找表征特定狀態(tài)的生物標(biāo)志物,分析不同狀態(tài)的代謝網(wǎng)絡(luò)缺陷或干預(yù)措施對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的影響,從而揭

5、示特定狀態(tài)的生物學(xué)本質(zhì)及干預(yù)措施的機(jī)制。由于代謝組學(xué)有全局性和動(dòng)態(tài)性的特點(diǎn),與中醫(yī)的整體觀相符,可系統(tǒng)而全面地揭示中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)與中藥藥理、毒理及其機(jī)制,因此該技術(shù)已逐漸應(yīng)用于中醫(yī)藥研究領(lǐng)域。
　　 目的：
　　 1、觀察大鼠乙酸性胃潰瘍發(fā)生與自愈過程中胃潰瘍面積與組織病理的動(dòng)態(tài)變化；觀察WWF對(duì)大鼠乙酸性胃潰瘍面積及組織病理的影響。
　　 2、運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)探討大鼠乙酸性胃潰瘍發(fā)生與自愈過程生物學(xué)特征的動(dòng)態(tài)變化

6、,并尋找表征這一過程的生物標(biāo)志物,根據(jù)標(biāo)志物的變化整體闡釋慢性胃潰瘍的發(fā)生與自愈機(jī)制,為全面評(píng)價(jià)抗胃潰瘍藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 3、從代謝組學(xué)角度評(píng)價(jià)WWF對(duì)大鼠乙酸性胃潰瘍的治療效果；根據(jù)WWF對(duì)胃潰瘍生物標(biāo)志物的影響,從系統(tǒng)與整體層面探討WWF的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、SPF級(jí)Wistar雄性大鼠完全隨機(jī)分為正常組、模型1天組、模型3天組、模型7天組、模型10天組(自愈組)、維胃方高、中、低劑量

7、組與雷尼替丁組(治療對(duì)照組),每組8只。采用冰醋酸灼燒大鼠胃竇前壁漿膜層制備胃潰瘍模型。測(cè)量不同時(shí)間模型組及治療組的胃潰瘍面積,制備病理組織切片,HE染色。
　　 2、收集各組大鼠胃黏膜及12h尿液,胃黏膜制備勻漿后進(jìn)行衍生化,尿液直接衍生化；采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)測(cè)定各組大鼠的胃黏膜與尿液的代謝物譜。運(yùn)用GC—MC工作站對(duì)代謝物譜進(jìn)行峰面積積分,峰判別與對(duì)齊,扣除溶劑峰與雜質(zhì)峰,挑選共有峰進(jìn)行歸一化處理,得到

8、由共有峰號(hào)、樣品號(hào)及歸一化后的峰強(qiáng)度組成的矩陣,將其導(dǎo)入模式識(shí)別軟件SIMCA—P+12.0(瑞典,Umetrics AB,Umea)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,行主成分分析(PCA)與偏最小二乘法判別分析(PLS—DA)。PCA直觀觀察不同時(shí)間模型組的動(dòng)態(tài)變化及藥物治療效果；PLS—DA進(jìn)一步考察組間的區(qū)分程度,并根據(jù)各代謝物的投影重要性(VIP)評(píng)價(jià)不同物質(zhì)與分類的相關(guān)性程度,以VIP值>1的代謝物作為潛在生物標(biāo)志物。運(yùn)用SPSS13.0軟件對(duì)

9、不同組潛在生物標(biāo)志物水平的差異進(jìn)行單維統(tǒng)計(jì)分析,選擇差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的物質(zhì)作為最終的生物標(biāo)志物。根據(jù)大鼠乙酸性胃潰瘍不同時(shí)間模型組生物標(biāo)志物水平的變化,結(jié)合現(xiàn)有的生物化學(xué)知識(shí)與研究闡釋胃潰瘍發(fā)生與自愈機(jī)制；根據(jù)維胃方對(duì)胃潰瘍生物標(biāo)志物的影響,探討WWF治療胃潰瘍的療效機(jī)制。
　　 3、計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)；多組均數(shù)比較采用單向方差分析(One—way ANOVA),若方差齊性,

10、采用LSD法多重比較；若方差不齊,則Welch法校正后采用Games—Howell法多重比較；所有檢驗(yàn)水平α=0.05(雙側(cè))。
　　 結(jié)果：
　　 1、胃黏膜標(biāo)本大體觀察:正常組大鼠胃黏膜光滑完整,色淡紅,未見充血水腫、糜爛出血；模型1天組胃竇前壁隱約可見一直徑2～5mm的缺損狀病灶,周圍充血水腫；3天組形成直徑5～6mm的明顯潰瘍,中心凹陷,覆蓋灰白色或黃白色苔狀物,邊界清楚,周圍堤狀,水腫明顯；模型7天組、10天組

11、潰瘍面稍縮小,周圍蒼白色瘢痕組織增生形成皺壁。WWF中劑量組潰瘍修復(fù)良好,無(wú)苔,皺襞平滑向中心集中；WWF高、低劑量組潰瘍明顯縮小,薄白苔覆蓋,周圍炎癥消退,皺襞集中；雷尼替丁組基本同WWF高、低劑量組。
　　 2、潰瘍面積比較:不同時(shí)間模型組與治療組的胃潰瘍面積(S)方差分析結(jié)果組顯示間總體均數(shù)有顯著性差異(P<0.01)。多重比較結(jié)果顯示,模型3天組S顯著大于模型1天組(P<0.05)；模型7天組胃潰瘍與模型3天組比較,S顯

12、著減少(P<0.05)；模型10天組(自愈組)與模型3天組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型3天組及自愈組比較,各用藥組的S顯著減小(P<0.01)；維胃方中劑量組S顯著小于雷尼替丁組(P<0.05),而維胃方高、低劑量組與雷尼替丁組S無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 3、病理變化:正常組:黏膜層光滑完整,腺細(xì)胞排列均勻,黏膜下層、肌層、漿膜層完好。模型1天組:黏膜出現(xiàn)缺損,部分腺體被破壞；黏膜下層毛細(xì)血管血流瘀滯

13、；黏膜下層及漿膜層被大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型3天組:黏膜缺損大,腺體完全被破壞、消失；黏膜下層毛細(xì)血管內(nèi)除有血流瘀滯外,部分毛細(xì)血管破裂、出血,黏膜下層、漿膜層仍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型7天組:黏膜缺損達(dá)肌層,出現(xiàn)少量紊亂排列的再生腺細(xì)胞,黏膜下層有一定量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),毛細(xì)血管內(nèi)血栓存在；自愈組:部分黏膜缺損達(dá)肌層,再生腺細(xì)胞排列紊亂；黏膜下層有炎細(xì)胞浸潤(rùn),見明顯血栓。雷尼替丁組:缺損較小,表面見新生上皮細(xì)胞及腺細(xì)胞,排列致密不整齊；黏

14、膜下層有炎細(xì)胞浸潤(rùn),肌層有瘢痕纖維形成。維胃方組高、低劑量組:缺損減小,再生腺細(xì)胞密度不勻,黏膜下層炎細(xì)胞浸潤(rùn),其中高劑量組增生的腺細(xì)胞數(shù)量較多,黏膜下血管未見明顯病理改變。維胃方中劑量組:黏膜基本完整,腺體細(xì)胞增生數(shù)量較多,排列較整齊；黏膜下層僅見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 4、各時(shí)間模型組的胃黏膜生物標(biāo)志物及其變化:模型1天組的生物標(biāo)志物中膽甾醇、硬脂酸、花生四烯酸、油酸、亞油酸、軟脂酸、乳酸、蘋果酸與煙酰胺水平顯著高于正常組

15、(P<0.01),賴氨酸、焦谷氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酸、丙氨酸、組氨酸、甘氨酸、蛋氨酸與纈氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01)。模型3天組的生物標(biāo)志物中花生四烯酸、膽甾醇、油酸、軟脂酸、硬脂酸、蘋果酸、乳酸與亞油酸水平顯著高于正常組(P<0.01),賴氨酸、酪氨酸、焦谷氨酸、谷氨酸、組氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸與丙氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01)。模型7天組的生物標(biāo)志物中花生四烯酸、膽甾醇、軟脂酸、亞油酸、硬脂酸、煙酰胺

16、、蘋果酸、油酸、乳酸、谷氨酰胺、色氨酸與α-羥基苯乙酸水平顯著高于正常組(P<0.01),酪氨酸、谷氨酸、脯氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甘氨酸、焦谷氨酸、組氨酸與苯丙氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01)。模型10天組的生物標(biāo)志物中花生四烯酸、異亮氨酸、天冬氨酸、蘋果酸、半胱氨酸、膽甾醇、乳酸、3-甲基胞嘧啶與纈氨酸水平顯著高于正常組(P<0.01),脯氨酸、硬脂酸、油酸、谷氨酸、軟脂酸、二甲基甘氨酸、賴氨酸、亞油酸與酪氨酸水平顯著低于正常組

17、(P<0.01)。
　　 5、表征大鼠胃潰瘍發(fā)生與自愈動(dòng)態(tài)過程的胃黏膜生物標(biāo)志物包括:花生四烯酸、蘋果酸、異亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、乳酸、蛋氨酸、谷氨酸、酪氨酸、膽甾醇、賴氨酸、油酸、焦谷氨酸、硬脂酸、組氨酸與軟脂酸。這些胃黏膜標(biāo)志物在胃潰瘍的不同階段呈動(dòng)態(tài)變化。
　　 6、各時(shí)間模型組尿液生物標(biāo)志物及其變化:模型1天組的生物標(biāo)志物中檸檬酸、馬尿酸、烏頭酸、琥珀酸、5-乙酰胺基戊酸、吲哚乙酸與異檸檬酸

18、水平顯著高于正常組(P<0.01),苯乙尿酸、3-丁酮酸、對(duì)羥基苯乙酸、3-羥基己酸、3-羥基丁酸與脯氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01)。模型3天組的生物標(biāo)志物中苯乙尿酸、對(duì)羥基苯乙酸、5-乙酰胺基戊酸、苯乙酸、酪胺與丙二酸水平顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05),檸檬酸、馬尿酸、烏頭酸、琥珀酸、吲哚乙酸、異檸檬酸與喹哪啶酸水平顯著低于正常組(P<0.01)。模型7天組的生物標(biāo)志物中苯乙尿酸、5-乙酰胺基戊酸、3-羥基丁酸、

19、對(duì)羥基苯乙酸、苯乙酸與苯甲酸水平顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05),馬尿酸、檸檬酸、琥珀酸、喹哪啶酸、甘氨酸、3-甲氧基苯基丙酸、甲基丙二酸、吲哚乙酸與異檸檬酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。模型10天組的生物標(biāo)志物中苯乙尿酸、5-乙酰胺基戊酸、對(duì)羥基苯乙酸與吲哚乙酸水平顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05),檸檬酸、烏頭酸、喹哪啶酸、3-甲氧苯基丙酸、琥珀酸與甘氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P

20、<0.05)。
　　 7、表征大鼠胃潰瘍發(fā)生與自愈動(dòng)態(tài)過程的尿液生物標(biāo)志物包括:苯乙尿酸、5-乙酰胺基戊酸、檸檬酸、馬尿酸、烏頭酸、3-羥基己酸、3-丁酮酸、甘氨酸、喹哪啶酸、琥珀酸、對(duì)羥基苯乙酸、庚二酸、脯氨酸、吲哚乙酸與苯乙酸。這些尿液標(biāo)志物在胃潰瘍的不同階段呈動(dòng)態(tài)變化。
　　 8、治療組胃黏膜生物標(biāo)志物及其變化:表征雷尼替丁組與正常組差異的生物標(biāo)志物中花生四烯酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、乳酸、色氨酸、異亮氨酸、

21、蘋果酸與天冬氨酸水平顯著高于正常組(P<0.01),膽甾醇、酪氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、油酸、焦谷氨酸、賴氨酸、軟脂酸與硬脂酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。表征WWF高劑量組與正常組差異的生物標(biāo)志物中嘧啶酮、亮氨酸、3-乙酰胺基丙醛與賴氨酸水平顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05),酪氨酸、羥脯氨酸、油酸、甘氨酸、丙氨酸與花生四烯酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。表征WWF中劑量組與正常組

22、的差異的生物標(biāo)志物中谷氨酸、組氨酸、亮氨酸與賴氨酸水平顯著高于正常組(P<0.05),酪氨酸與脯氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。表征WWF低劑量組與正常組的生物標(biāo)志物中3-乙酰胺基丙醛、賴氨酸、亮氨酸、嘧啶酮與煙酰胺水平顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05),酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、焦谷氨酸與纈氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。不同藥物對(duì)胃黏膜胃潰瘍標(biāo)志物有不同程度的回調(diào),以中劑量

23、WWF為佳。
　　 9、治療組尿液生物標(biāo)志物及其變化:表征雷尼替丁組與正常組差異的生物標(biāo)志物中苯乙尿酸、酪胺、對(duì)羥基苯乙酸與苯乙酸水平顯著高于正常組(P<0.01),檸檬酸、5-乙酰胺基戊酸、喹哪啶酸、琥珀酸、吲哚乙酸、乙基丙二酸與蘋果酸水平顯著低于正常組(P<0.01)。表征WWF高劑量組與正常組差異的生物標(biāo)志物中苯乙尿酸與脯氨酸水平顯著高于正常組(P<0.05),檸檬酸、烏頭酸、3-甲氧苯基丙酸、吲哚乙酸、琥珀酸、高檸檬酸、

24、喹哪啶酸與α-酮戊二酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。表征WWF中劑量組與正常組差異的生物標(biāo)志物中脯氨酸與3-羥基苯乙酸水平顯著高于正常組(P<0.01),3-甲氧苯基丙酸、吲哚乙酸與高檸檬酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。表征WWF低劑量組與正常組差異的生物標(biāo)志物中苯乙尿酸、乙基丙二酸、酪胺與脯氨酸水平顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05),檸檬酸、烏頭酸、吲哚乙酸、3-甲氧苯基丙酸、琥珀酸、

25、喹哪啶酸、天冬氨酸與高檸檬酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。不同藥物對(duì)尿液胃潰瘍標(biāo)志物有不同程度的回調(diào),以中劑量WWF為佳。
　　 結(jié)論：
　　 1、大鼠乙酸性胃潰瘍不同時(shí)間模型組胃黏膜的大體觀察與胃潰瘍面積比較表明:模型1天組處于潰瘍發(fā)生階段,模型3天組處于潰瘍完全形成階段,模型7天組、10天組處于不同的愈合階段,但自愈效果不理想。組織病理表明:大鼠乙酸性胃潰瘍形成與胃黏膜的炎癥損傷及微循環(huán)障礙密切相

26、關(guān):自愈機(jī)制下修復(fù)的胃黏膜再生組織結(jié)構(gòu)異常,是潰瘍易于復(fù)發(fā)的組織學(xué)基礎(chǔ)。
　　 2、治療組胃黏膜標(biāo)本的大體觀察與潰瘍面積比較表明:WWF中劑量組胃潰瘍愈合效果最佳,而WWF高、低劑量組愈合較差,與雷尼替丁組類似,但優(yōu)于自愈組。組織病理表明:WWF中劑量組的再生組織結(jié)構(gòu)更接近正常組織。
　　 3、運(yùn)用基于GC—MS的代謝組學(xué)技術(shù),揭示了大鼠乙酸性胃潰瘍發(fā)生與自愈過程胃黏膜與尿液代謝物譜的動(dòng)態(tài)變化,獲得了表征其生物學(xué)特征的代

27、謝標(biāo)志物,包括有機(jī)酸、類脂、脂肪酸、氨基酸與胺類等；這些標(biāo)志物在不同時(shí)間模型組的變化,表明大鼠胃潰瘍發(fā)生與自愈過程的能量代謝、物質(zhì)代謝與神經(jīng)調(diào)節(jié)處于紊亂狀態(tài)。
　　 4、運(yùn)用基于GC—MS的代謝組學(xué)技術(shù),獲得了表征雷尼替丁及維胃方高、中、低劑量治療組生物學(xué)特征的胃黏膜及尿液生物標(biāo)志物。不同藥物對(duì)胃黏膜及尿液的胃潰瘍標(biāo)志物水平呈現(xiàn)不同程度的回調(diào),尤以中劑量WWF的回調(diào)程度最大,表明中劑量WWF治療乙酸性胃潰瘍療效最佳；WWF通過整