大鼠乙酸性胃潰瘍及維胃方治療的代謝組學研究.pdf

1、背景：
　　 胃潰瘍病(Gastric Ulcer,GU)是常見的消化系統(tǒng)疾病,由胃液對胃黏膜自身消化所形成的潰瘍樣病變。GU發(fā)病機制復雜,現(xiàn)代醫(yī)學認為該病是致潰瘍的攻擊因子與保護胃黏膜的防御因子失衡所致。其主要病因包括:胃酸與胃蛋白酶作用,幽門螺桿菌(H.pylori,Hp)感染,非甾體抗炎藥(NSAID)使用,胃十二指腸動力異常,應激及遺傳因素影響等,其中胃酸、蛋白酶、Hp對GU的發(fā)病起主導作用。近年來,由于組胺-2受體拮抗

2、劑(H2RA)、質子泵抑制劑(PPI)與Hp根除方案的廣泛使用,GU容易達到近期治愈效果,但停藥后其復發(fā)率高,這與潰瘍愈合質量(QOUH)不高有關。中醫(yī)學認為胃潰瘍屬“胃脘痛”范疇,其發(fā)生與情緒、飲食所傷、脾胃虛弱等密切相關。中醫(yī)治療GU重在辨證施治,通過中藥的綜合作用機制,顯著提高胃潰瘍的QOUH,降低潰瘍復發(fā)率。
　　 維胃方(WWF)是臨床治療胃潰瘍的經驗方。前期的實驗研究表明,維胃方可調節(jié)乙酸性胃潰瘍大鼠血清胃泌素(GA

3、S)、血漿神經降壓素(NT)、表皮生長因子(EGF)、白介素-2(IL-2)、一氧化氮(NO)的水平及誘生型一氧化氮合酶(iNOS)的活性,提高胃黏膜中氨基己糖的含量,從而減輕胃黏膜損傷,增強胃黏膜屏障,有效促進胃潰瘍愈合。
　　 大鼠乙酸性胃潰瘍模型是經典的胃潰瘍模型,其自愈時間長且愈合后容易復發(fā)的特點及其病理特征與人類慢性胃潰瘍的特點十分相似,現(xiàn)已廣泛用于抗?jié)兯幬锏乃幮c作用機制研究,但該模型的發(fā)生與自愈機制仍不甚明確。另

4、外,運用該模型評價抗胃潰瘍中藥時,往往選擇單一指標或若干個指標進行,不能系統(tǒng)反映中藥多靶點綜合作用的特點。
　　 代謝組學(Metabonomics)是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學后的一種新的生物組學技術。它運用系統(tǒng)研究手段,分析生物體受病理生理或基因變異等刺激或藥物作用后,其整體內源性小分子代謝物質的動態(tài)應答變化；再運用模式識別技術,尋找表征特定狀態(tài)的生物標志物,分析不同狀態(tài)的代謝網絡缺陷或干預措施對代謝網絡的影響,從而揭

5、示特定狀態(tài)的生物學本質及干預措施的機制。由于代謝組學有全局性和動態(tài)性的特點,與中醫(yī)的整體觀相符,可系統(tǒng)而全面地揭示中醫(yī)證候實質與中藥藥理、毒理及其機制,因此該技術已逐漸應用于中醫(yī)藥研究領域。
　　 目的：
　　 1、觀察大鼠乙酸性胃潰瘍發(fā)生與自愈過程中胃潰瘍面積與組織病理的動態(tài)變化；觀察WWF對大鼠乙酸性胃潰瘍面積及組織病理的影響。
　　 2、運用代謝組學技術探討大鼠乙酸性胃潰瘍發(fā)生與自愈過程生物學特征的動態(tài)變化

6、,并尋找表征這一過程的生物標志物,根據標志物的變化整體闡釋慢性胃潰瘍的發(fā)生與自愈機制,為全面評價抗胃潰瘍藥物提供實驗依據。
　　 3、從代謝組學角度評價WWF對大鼠乙酸性胃潰瘍的治療效果；根據WWF對胃潰瘍生物標志物的影響,從系統(tǒng)與整體層面探討WWF的作用機制。
　　 方法：
　　 1、SPF級Wistar雄性大鼠完全隨機分為正常組、模型1天組、模型3天組、模型7天組、模型10天組(自愈組)、維胃方高、中、低劑量

7、組與雷尼替丁組(治療對照組),每組8只。采用冰醋酸灼燒大鼠胃竇前壁漿膜層制備胃潰瘍模型。測量不同時間模型組及治療組的胃潰瘍面積,制備病理組織切片,HE染色。
　　 2、收集各組大鼠胃黏膜及12h尿液,胃黏膜制備勻漿后進行衍生化,尿液直接衍生化；采用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(GC-MS)測定各組大鼠的胃黏膜與尿液的代謝物譜。運用GC—MC工作站對代謝物譜進行峰面積積分,峰判別與對齊,扣除溶劑峰與雜質峰,挑選共有峰進行歸一化處理,得到

8、由共有峰號、樣品號及歸一化后的峰強度組成的矩陣,將其導入模式識別軟件SIMCA—P+12.0(瑞典,Umetrics AB,Umea)進行標準化處理,行主成分分析(PCA)與偏最小二乘法判別分析(PLS—DA)。PCA直觀觀察不同時間模型組的動態(tài)變化及藥物治療效果；PLS—DA進一步考察組間的區(qū)分程度,并根據各代謝物的投影重要性(VIP)評價不同物質與分類的相關性程度,以VIP值>1的代謝物作為潛在生物標志物。運用SPSS13.0軟件對

9、不同組潛在生物標志物水平的差異進行單維統(tǒng)計分析,選擇差異有統(tǒng)計學意義的物質作為最終的生物標志物。根據大鼠乙酸性胃潰瘍不同時間模型組生物標志物水平的變化,結合現(xiàn)有的生物化學知識與研究闡釋胃潰瘍發(fā)生與自愈機制；根據維胃方對胃潰瘍生物標志物的影響,探討WWF治療胃潰瘍的療效機制。
　　 3、計量資料以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,兩組均數(shù)比較采用獨立樣本T檢驗；多組均數(shù)比較采用單向方差分析(One—way ANOVA),若方差齊性,

10、采用LSD法多重比較；若方差不齊,則Welch法校正后采用Games—Howell法多重比較；所有檢驗水平α=0.05(雙側)。
　　 結果：
　　 1、胃黏膜標本大體觀察:正常組大鼠胃黏膜光滑完整,色淡紅,未見充血水腫、糜爛出血；模型1天組胃竇前壁隱約可見一直徑2～5mm的缺損狀病灶,周圍充血水腫；3天組形成直徑5～6mm的明顯潰瘍,中心凹陷,覆蓋灰白色或黃白色苔狀物,邊界清楚,周圍堤狀,水腫明顯；模型7天組、10天組

11、潰瘍面稍縮小,周圍蒼白色瘢痕組織增生形成皺壁。WWF中劑量組潰瘍修復良好,無苔,皺襞平滑向中心集中；WWF高、低劑量組潰瘍明顯縮小,薄白苔覆蓋,周圍炎癥消退,皺襞集中；雷尼替丁組基本同WWF高、低劑量組。
　　 2、潰瘍面積比較:不同時間模型組與治療組的胃潰瘍面積(S)方差分析結果組顯示間總體均數(shù)有顯著性差異(P<0.01)。多重比較結果顯示,模型3天組S顯著大于模型1天組(P<0.05)；模型7天組胃潰瘍與模型3天組比較,S顯

12、著減少(P<0.05)；模型10天組(自愈組)與模型3天組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型3天組及自愈組比較,各用藥組的S顯著減小(P<0.01)；維胃方中劑量組S顯著小于雷尼替丁組(P<0.05),而維胃方高、低劑量組與雷尼替丁組S無顯著性差異(P>0.05)。
　　 3、病理變化:正常組:黏膜層光滑完整,腺細胞排列均勻,黏膜下層、肌層、漿膜層完好。模型1天組:黏膜出現(xiàn)缺損,部分腺體被破壞；黏膜下層毛細血管血流瘀滯

13、；黏膜下層及漿膜層被大量炎性細胞浸潤。模型3天組:黏膜缺損大,腺體完全被破壞、消失；黏膜下層毛細血管內除有血流瘀滯外,部分毛細血管破裂、出血,黏膜下層、漿膜層仍有大量炎性細胞浸潤。模型7天組:黏膜缺損達肌層,出現(xiàn)少量紊亂排列的再生腺細胞,黏膜下層有一定量的炎性細胞浸潤,毛細血管內血栓存在；自愈組:部分黏膜缺損達肌層,再生腺細胞排列紊亂；黏膜下層有炎細胞浸潤,見明顯血栓。雷尼替丁組:缺損較小,表面見新生上皮細胞及腺細胞,排列致密不整齊；黏

14、膜下層有炎細胞浸潤,肌層有瘢痕纖維形成。維胃方組高、低劑量組:缺損減小,再生腺細胞密度不勻,黏膜下層炎細胞浸潤,其中高劑量組增生的腺細胞數(shù)量較多,黏膜下血管未見明顯病理改變。維胃方中劑量組:黏膜基本完整,腺體細胞增生數(shù)量較多,排列較整齊；黏膜下層僅見少量炎性細胞浸潤。
　　 4、各時間模型組的胃黏膜生物標志物及其變化:模型1天組的生物標志物中膽甾醇、硬脂酸、花生四烯酸、油酸、亞油酸、軟脂酸、乳酸、蘋果酸與煙酰胺水平顯著高于正常組

15、(P<0.01),賴氨酸、焦谷氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酸、丙氨酸、組氨酸、甘氨酸、蛋氨酸與纈氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01)。模型3天組的生物標志物中花生四烯酸、膽甾醇、油酸、軟脂酸、硬脂酸、蘋果酸、乳酸與亞油酸水平顯著高于正常組(P<0.01),賴氨酸、酪氨酸、焦谷氨酸、谷氨酸、組氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸與丙氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01)。模型7天組的生物標志物中花生四烯酸、膽甾醇、軟脂酸、亞油酸、硬脂酸、煙酰胺

16、、蘋果酸、油酸、乳酸、谷氨酰胺、色氨酸與α-羥基苯乙酸水平顯著高于正常組(P<0.01),酪氨酸、谷氨酸、脯氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甘氨酸、焦谷氨酸、組氨酸與苯丙氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01)。模型10天組的生物標志物中花生四烯酸、異亮氨酸、天冬氨酸、蘋果酸、半胱氨酸、膽甾醇、乳酸、3-甲基胞嘧啶與纈氨酸水平顯著高于正常組(P<0.01),脯氨酸、硬脂酸、油酸、谷氨酸、軟脂酸、二甲基甘氨酸、賴氨酸、亞油酸與酪氨酸水平顯著低于正常組

17、(P<0.01)。
　　 5、表征大鼠胃潰瘍發(fā)生與自愈動態(tài)過程的胃黏膜生物標志物包括:花生四烯酸、蘋果酸、異亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、乳酸、蛋氨酸、谷氨酸、酪氨酸、膽甾醇、賴氨酸、油酸、焦谷氨酸、硬脂酸、組氨酸與軟脂酸。這些胃黏膜標志物在胃潰瘍的不同階段呈動態(tài)變化。
　　 6、各時間模型組尿液生物標志物及其變化:模型1天組的生物標志物中檸檬酸、馬尿酸、烏頭酸、琥珀酸、5-乙酰胺基戊酸、吲哚乙酸與異檸檬酸

18、水平顯著高于正常組(P<0.01),苯乙尿酸、3-丁酮酸、對羥基苯乙酸、3-羥基己酸、3-羥基丁酸與脯氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01)。模型3天組的生物標志物中苯乙尿酸、對羥基苯乙酸、5-乙酰胺基戊酸、苯乙酸、酪胺與丙二酸水平顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05),檸檬酸、馬尿酸、烏頭酸、琥珀酸、吲哚乙酸、異檸檬酸與喹哪啶酸水平顯著低于正常組(P<0.01)。模型7天組的生物標志物中苯乙尿酸、5-乙酰胺基戊酸、3-羥基丁酸、

19、對羥基苯乙酸、苯乙酸與苯甲酸水平顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05),馬尿酸、檸檬酸、琥珀酸、喹哪啶酸、甘氨酸、3-甲氧基苯基丙酸、甲基丙二酸、吲哚乙酸與異檸檬酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。模型10天組的生物標志物中苯乙尿酸、5-乙酰胺基戊酸、對羥基苯乙酸與吲哚乙酸水平顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05),檸檬酸、烏頭酸、喹哪啶酸、3-甲氧苯基丙酸、琥珀酸與甘氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P

20、<0.05)。
　　 7、表征大鼠胃潰瘍發(fā)生與自愈動態(tài)過程的尿液生物標志物包括:苯乙尿酸、5-乙酰胺基戊酸、檸檬酸、馬尿酸、烏頭酸、3-羥基己酸、3-丁酮酸、甘氨酸、喹哪啶酸、琥珀酸、對羥基苯乙酸、庚二酸、脯氨酸、吲哚乙酸與苯乙酸。這些尿液標志物在胃潰瘍的不同階段呈動態(tài)變化。
　　 8、治療組胃黏膜生物標志物及其變化:表征雷尼替丁組與正常組差異的生物標志物中花生四烯酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、乳酸、色氨酸、異亮氨酸、

21、蘋果酸與天冬氨酸水平顯著高于正常組(P<0.01),膽甾醇、酪氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、油酸、焦谷氨酸、賴氨酸、軟脂酸與硬脂酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。表征WWF高劑量組與正常組差異的生物標志物中嘧啶酮、亮氨酸、3-乙酰胺基丙醛與賴氨酸水平顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05),酪氨酸、羥脯氨酸、油酸、甘氨酸、丙氨酸與花生四烯酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。表征WWF中劑量組與正常組

22、的差異的生物標志物中谷氨酸、組氨酸、亮氨酸與賴氨酸水平顯著高于正常組(P<0.05),酪氨酸與脯氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。表征WWF低劑量組與正常組的生物標志物中3-乙酰胺基丙醛、賴氨酸、亮氨酸、嘧啶酮與煙酰胺水平顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05),酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、焦谷氨酸與纈氨酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。不同藥物對胃黏膜胃潰瘍標志物有不同程度的回調,以中劑量

23、WWF為佳。
　　 9、治療組尿液生物標志物及其變化:表征雷尼替丁組與正常組差異的生物標志物中苯乙尿酸、酪胺、對羥基苯乙酸與苯乙酸水平顯著高于正常組(P<0.01),檸檬酸、5-乙酰胺基戊酸、喹哪啶酸、琥珀酸、吲哚乙酸、乙基丙二酸與蘋果酸水平顯著低于正常組(P<0.01)。表征WWF高劑量組與正常組差異的生物標志物中苯乙尿酸與脯氨酸水平顯著高于正常組(P<0.05),檸檬酸、烏頭酸、3-甲氧苯基丙酸、吲哚乙酸、琥珀酸、高檸檬酸、

24、喹哪啶酸與α-酮戊二酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。表征WWF中劑量組與正常組差異的生物標志物中脯氨酸與3-羥基苯乙酸水平顯著高于正常組(P<0.01),3-甲氧苯基丙酸、吲哚乙酸與高檸檬酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。表征WWF低劑量組與正常組差異的生物標志物中苯乙尿酸、乙基丙二酸、酪胺與脯氨酸水平顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05),檸檬酸、烏頭酸、吲哚乙酸、3-甲氧苯基丙酸、琥珀酸、

25、喹哪啶酸、天冬氨酸與高檸檬酸水平顯著低于正常組(P<0.01或P<0.05)。不同藥物對尿液胃潰瘍標志物有不同程度的回調,以中劑量WWF為佳。
　　 結論：
　　 1、大鼠乙酸性胃潰瘍不同時間模型組胃黏膜的大體觀察與胃潰瘍面積比較表明:模型1天組處于潰瘍發(fā)生階段,模型3天組處于潰瘍完全形成階段,模型7天組、10天組處于不同的愈合階段,但自愈效果不理想。組織病理表明:大鼠乙酸性胃潰瘍形成與胃黏膜的炎癥損傷及微循環(huán)障礙密切相

26、關:自愈機制下修復的胃黏膜再生組織結構異常,是潰瘍易于復發(fā)的組織學基礎。
　　 2、治療組胃黏膜標本的大體觀察與潰瘍面積比較表明:WWF中劑量組胃潰瘍愈合效果最佳,而WWF高、低劑量組愈合較差,與雷尼替丁組類似,但優(yōu)于自愈組。組織病理表明:WWF中劑量組的再生組織結構更接近正常組織。
　　 3、運用基于GC—MS的代謝組學技術,揭示了大鼠乙酸性胃潰瘍發(fā)生與自愈過程胃黏膜與尿液代謝物譜的動態(tài)變化,獲得了表征其生物學特征的代

27、謝標志物,包括有機酸、類脂、脂肪酸、氨基酸與胺類等；這些標志物在不同時間模型組的變化,表明大鼠胃潰瘍發(fā)生與自愈過程的能量代謝、物質代謝與神經調節(jié)處于紊亂狀態(tài)。
　　 4、運用基于GC—MS的代謝組學技術,獲得了表征雷尼替丁及維胃方高、中、低劑量治療組生物學特征的胃黏膜及尿液生物標志物。不同藥物對胃黏膜及尿液的胃潰瘍標志物水平呈現(xiàn)不同程度的回調,尤以中劑量WWF的回調程度最大,表明中劑量WWF治療乙酸性胃潰瘍療效最佳；WWF通過整