骨髓移植新策略-磁力誘導(dǎo)細(xì)胞靶向移植模型的建立與研究.pdf

1、目的：
　　1.建立eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植模型，觀察移植后骨髓腔內(nèi)HSCs的空間分布和定位。
　　2.建立eGFP和mRFP雙熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠異基因骨髓移植模型，觀察移植后骨髓腔內(nèi)HSCs的空間分布和定位。
　　3.在eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植模型中，探索Magic-TT是否可提高移植后細(xì)胞的歸巢率，縮短造血和免疫重建時(shí)間。
　　研究?jī)?nèi)容：
　　第一部分eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基

2、因小鼠同基因骨髓移植后骨髓腔內(nèi)HSCs的空間分布和定位
　　方法：(1)20只C57BL/6受者雌性普通小鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各10只，移植前腸道準(zhǔn)備;(2)5只C57BL/6雄性eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因供者小鼠，脫臼后取雙側(cè)股骨，制備成骨髓懸浮液;(3)兩組小鼠經(jīng)7Gy強(qiáng)度清髓性放療后，實(shí)驗(yàn)組尾靜脈輸注0.1ml骨髓液，細(xì)胞數(shù)約(5×106)/只，對(duì)照組尾靜脈輸注0.1mlPBS;(4)移植后觀察兩組小鼠的一般情況、植入水

3、平、造血恢復(fù)和生存期等。在受鼠造血恢復(fù)的過(guò)程中，取股骨半固體脫鈣后，用共聚焦顯微鏡等觀察骨髓中供者綠熒光細(xì)胞的分布、形態(tài)和定位等。
　　結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)組小鼠的造血恢復(fù)為（19.87±1.81）天，外周血中RFP+比例為(92.67±6.65)％;(2)對(duì)照組移植后第5天開始有小鼠死亡，第11天全部死亡，中位生存期為7.5d，死亡原因?yàn)樵煅ソ?，死亡時(shí)外周血白細(xì)胞均＜0.5×109/L，病死率達(dá)100％;(3)受鼠股骨經(jīng)半固體脫鈣

4、后，直接在共聚焦顯微鏡下可清晰的觀察到骨髓腔中供者綠熒光細(xì)胞的形態(tài)和空間分布。
　　小結(jié)：本部分實(shí)驗(yàn)使用eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠成功構(gòu)建了eGFP→普通小鼠的同基因骨髓移植模型。供者細(xì)胞自帶綠熒光，該模型有助于探索移植后供者細(xì)胞在受者體內(nèi)的遷移和分布，同時(shí)結(jié)合本團(tuán)隊(duì)自創(chuàng)的半固體脫鈣法，在緩慢脫鈣的過(guò)程中半固體成分輕微流動(dòng)，作為支撐成分逐步替代股骨中的鈣質(zhì)成分，原位保留了股骨中供者細(xì)胞的位置、形態(tài)和熒光，在共聚焦顯微鏡下可清晰地觀

5、察到移植后受鼠骨髓中供者細(xì)胞的分布、形態(tài)和地位，為探索移植后受鼠骨髓中供者細(xì)胞的分布、歸巢和尋找造血干細(xì)胞“龕”的位置提供了新的思路，具有應(yīng)用價(jià)值。
　　第二部分eGFP和mRFP雙熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠異基因骨髓移植后骨髓腔內(nèi)HSCs的空間分布和定位
　　方法：(1)20只C57BL/6雌性eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各10只，移植前腸道準(zhǔn)備;(2)5只FVB雄性mRFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因供者小鼠，脫臼后取雙側(cè)股骨

6、，制備成骨髓懸浮液;(3)兩組小鼠經(jīng)7.5Gy強(qiáng)度清髓性放療后，實(shí)驗(yàn)組尾靜脈輸注0.2ml骨髓液，細(xì)胞數(shù)約(5.0×106)/只，對(duì)照組尾靜脈輸注0.2ml PBS;(4)移植后觀察兩組受鼠的一般情況、植入水平、造血恢復(fù)、移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率和生存期。在受鼠造血恢復(fù)的過(guò)程中，取股骨半固體脫鈣，用共聚焦顯微鏡等觀察骨髓中紅綠細(xì)胞的分布、形態(tài)和相互作用關(guān)系。
　　結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)組小鼠的造血恢復(fù)為（20.00±3.07）

7、天，外周血中RFP+比例為(93.94±1.59)％;1個(gè)月內(nèi)4/10只受鼠有aGVHD表現(xiàn);(2)對(duì)照組移植后第5天開始有小鼠死亡，第11天全部死亡，中位生存期為8.5d，死亡原因?yàn)樵煅ソ撸劳鰰r(shí)外周血白細(xì)胞均＜0.5×109/L，病死率達(dá)100％。(3)受鼠股骨經(jīng)半固體脫鈣后，共聚焦顯微鏡下可見骨髓腔中mRFP+細(xì)胞主要位于骨小梁周圍且被大量的GFP+細(xì)胞所包繞，三維構(gòu)建后可清楚地觀察到骨髓微環(huán)境中紅綠熒光細(xì)胞的相互作用。

8、　　小結(jié)：本部分實(shí)驗(yàn)使用eGFP和mRFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠成功構(gòu)建了mRFP→eGFP的雙熒光小鼠異基因骨髓移植模型，結(jié)合半固體脫鈣法可清晰的觀察到移植后骨髓中供者細(xì)胞的分布及供受者細(xì)胞間的相互關(guān)系，為臨床觀察移植后供者細(xì)胞的分布、歸巢等相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)。
　　第三部分Magic-TT在eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植中的研究
　　方法：(1)40只C57BL/6受者雌性普通小鼠，隨機(jī)分為4組，分別為A組:尾靜脈

9、+磁珠組、B組:尾靜脈+磁珠+小磁場(chǎng)組、C組:尾靜脈+磁珠+中磁場(chǎng)組、D組:尾靜脈+磁珠+大磁場(chǎng)組，各10只，移植前腸道準(zhǔn)備;(2)5只C57BL/6雄性eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因供者小鼠，脫臼后取雙側(cè)股骨，制備成骨髓懸浮液;(3)骨髓懸浮液中先后加入Anti-Sca-1-FITC、Anti-FITC磁珠孵化，使骨髓細(xì)胞中HSCs盡可能多的被納米磁珠標(biāo)記;(4)4組小鼠經(jīng)7Gy強(qiáng)度清髓性放療后，均分別尾靜脈輸注0.1ml含納米磁珠的骨髓液，

10、細(xì)胞數(shù)約(5×106)/只;(5)4組小鼠在移植后分別在股骨處不加磁場(chǎng)、加上弱磁場(chǎng)、中磁場(chǎng)和強(qiáng)磁場(chǎng)，24h后去除磁場(chǎng);(6)觀察4組小鼠的一般情況，監(jiān)測(cè)體重、血常規(guī)、嵌合率、生存期等。
　　結(jié)果：小鼠于照射后體重進(jìn)行性下降，伴活動(dòng)減少，1周后精神、活動(dòng)逐漸恢復(fù)，磁場(chǎng)組的部分小鼠磁鐵脫落，部分小鼠因磁鐵夾閉過(guò)緊而導(dǎo)致下肢紅腫甚至骨折。(1)4組小鼠的生存情況分別為:A組對(duì)照組移植后d17死亡2只，余生存時(shí)間＞30d，存活率80％;B

11、組弱磁場(chǎng)組小鼠全部存活，生存時(shí)間＞30d，存活率100％;C組中磁場(chǎng)組移植后d15死亡1只，余生存時(shí)間＞30d，存活率90％;D組強(qiáng)磁場(chǎng)組移植后d11死亡1只，余生存時(shí)間＞30d，存活率90％。4組小鼠移植后的生存時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)4組小鼠造血基本恢復(fù)時(shí)，外周血中RFP+比例分別為(91.35±9.81)％、(95.13±1.50)％、(94.23±0.86)％、(91.53±3.30)％，表明移植成功。(3)將4組小鼠移植后

12、的血常規(guī)進(jìn)行比較:白細(xì)胞P=0.081＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;血紅蛋白P=0.328＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;血小板P=0.007＜0.05，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)行組間的多重比較，A組與B組P=0.143＞0.05、A組與C組P為=0.624＞0.05，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A組與D組P=0.026＜0.05，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且D組平均血小板數(shù)高于A組，B組與C組P=0.010＜0.05，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且B組平均血小板數(shù)高于C組，D組

13、與C組P=0.000＜0.05，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且D組平均血小板數(shù)高于C組，B組與D組P=0.155＞0.05，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　小結(jié)：本部分實(shí)驗(yàn)在第一章eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植的基礎(chǔ)上，將供者小鼠的骨髓細(xì)胞磁化+受者小鼠的股骨部位加入不同梯度的磁場(chǎng)，探索在磁場(chǎng)的作用下對(duì)小鼠移植后造血恢復(fù)的影響。結(jié)果初步表明在本次實(shí)驗(yàn)所使用的磁場(chǎng)強(qiáng)度范圍內(nèi)，Magic-TT在eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植中，對(duì)白

14、細(xì)胞和血紅蛋白的恢復(fù)無(wú)明顯影響，但隨著磁場(chǎng)強(qiáng)度的增大，當(dāng)達(dá)到一定磁場(chǎng)強(qiáng)度后可以縮短移植后血小板的造血恢復(fù)時(shí)間，這對(duì)改善移植后機(jī)體的造血恢復(fù)有重要意義。
　　結(jié)論和展望：
　　通過(guò)以上三部分的實(shí)驗(yàn)研究，分別成功建立了eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植模型、紅綠雙熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠異基因骨髓移植模型。在以上兩種模型的基礎(chǔ)上，結(jié)合自創(chuàng)的半固體脫鈣體系，清晰地觀察到移植后骨髓腔內(nèi)紅綠熒光細(xì)胞的位置、形態(tài)及供受者細(xì)胞間的相互作用

15、關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)采用了熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行移植，供受者小鼠細(xì)胞自帶紅綠熒光便于觀察，該模型的建立對(duì)探索移植后供者細(xì)胞在受者小鼠體內(nèi)的分布、遷移、滯留等相關(guān)研究提供了極大便利，具有重要意義。同時(shí)結(jié)合自創(chuàng)的半固體脫鈣體系，使直接觀察移植后小鼠骨髓腔內(nèi)供受者細(xì)胞的位置、形態(tài)及相互作用關(guān)系更加清楚，為追蹤移植后HSCs的歸巢和探索移植后小鼠造血恢復(fù)過(guò)程中供受者細(xì)胞在骨髓微環(huán)境中的相互作用提供了更廣闊的思路，具有重大意義。
　　本實(shí)驗(yàn)的第三部

16、分探索了Magic-TT在eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植中，對(duì)移植后小鼠造血恢復(fù)的影響，初步證實(shí)了Magic-TT在本次實(shí)驗(yàn)所使用的磁場(chǎng)強(qiáng)度范圍內(nèi)對(duì)白細(xì)胞和血紅蛋白的恢復(fù)無(wú)明顯影響，但隨著磁場(chǎng)強(qiáng)度的增大，當(dāng)達(dá)到一定磁場(chǎng)強(qiáng)度后可以縮短移植后血小板的造血恢復(fù)時(shí)間，其深入研究和進(jìn)一步完善將會(huì)為臨床改善移植后患者血小板的恢復(fù)情況提供良好的方法，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　后期本課題的延續(xù)將考慮使用Magic-TT聯(lián)合骨髓腔內(nèi)移