博卡病毒感染的檢測和原始抗原效應(yīng)的相關(guān)研究.pdf

1、博卡病毒是近幾年被發(fā)現(xiàn)的一種人、豬、牛、犬、猩猩等多種哺乳動物共患的新型DNA病毒。人類博卡病毒(human bocavirus，HBoV)是2005年最早發(fā)現(xiàn)的新型博卡病毒。有相關(guān)研究指出HBoV存在于黑猩猩、大猩猩等靈長類動物，與大猩猩博卡病毒有著極其高的同源性;此外，研究HBoV的免疫學(xué)特性有利于更好的理解和研究其他新興的動物博卡病毒。
　　人類博卡病毒1型(HBoV1)普遍存在幼兒體內(nèi)，有可能會引起急性呼吸系統(tǒng)疾病。另外三

2、種人類博卡病毒(HBoV2-4)的感染常發(fā)生于胃腸道，可能與嬰幼兒腹瀉或胃腸炎相關(guān)。世界各地均有在血清、呼吸道等樣本中檢測到博卡病毒的報(bào)道;但博卡病毒的致病機(jī)理還不清楚。當(dāng)一些個體先后感染兩種相似的毒株后，機(jī)體產(chǎn)生的是針對初始感染毒株的抗體，而不是目前感染毒株的抗體。這種具有抗原相似性的病毒在免疫應(yīng)答上相互影響的現(xiàn)象，自1950年以來一直被稱為“原始抗原效應(yīng)”(original antigenic sin, OAS)。
　　本研究

3、采用3種不同的檢測方法-熒光定量PCR(qPCR)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)及MariPOC抗原檢測系統(tǒng)-檢測鼻咽腔分泌物樣本中HBoV1的存在。在269份樣本中，HBoV1 DNA在qPCR中的陽性率為8.1％(22/269)，樣品中的拷貝數(shù)在5.13E+01到7.23E+09copies/mL之間。RT-PCR陽性率為3.35％(9/269)，MariPOC抗原檢測系統(tǒng)陽性率為3.71％(10/269)，兩者檢測到病毒對應(yīng)的DN

4、A的最小拷貝數(shù)約為107copies/mL。初步判定在呼吸道樣本中HBoV1 DNA拷貝數(shù)大于107copies/mL時，病毒處于急性感染期。
　　為了研HBoV感染在人體內(nèi)的相互作用，本研究針對從過百名兒童從出生起按照每3-6個月的間隔收集的近兩千份血清進(jìn)行了研究。在該人群中，HBoV1 DNA的檢出率最高為24％; HBoV2-4DNA的檢出率分別為6％、1％和1％。抗HBoV1 IgM的陽性率為32％，HBoV2 IgM的陽

5、性率為10％，并未發(fā)現(xiàn)HBoV3 IgM的陽性樣本?？笲oV1-3 IgG中陽性率最高的為抗HBoV1 IgG(86.2％);抗BoV2 IgG的陽性率為53.2％，抗HBoV3 IgG的陽性率為10.1％。上述結(jié)果均表明HBoV1的感染率最高，其次為HBoV2，HBoV3最差。上述血清樣本中，發(fā)現(xiàn)在有一種以上HBoV的感染的兒童中，一些個體在感染第二種HBoV后，繼發(fā)性的感染并不能導(dǎo)致特異性的抗體響應(yīng)。因此認(rèn)為HBoV1-4的感染存在

6、原始抗原效應(yīng)，本文對其進(jìn)行后續(xù)研究。
　　為了能夠在可控條件下研究在人類血清中觀測到的原始抗原效應(yīng)，本研究利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了HBoV4 VP2蛋白的病毒樣粒子并大規(guī)模表達(dá)了HBoV1-4 VP2蛋白的病毒樣粒子，同時優(yōu)化了將用于測試原始抗原效應(yīng)的檢測方法。首先，成功構(gòu)建了pAcUW51-HBoV4-VP2桿狀病毒載體，進(jìn)行體外鑒定無誤后，提取重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，收獲重組病毒并表達(dá)了目的蛋白。經(jīng)SDS-P

7、AGE鑒定，重組蛋白在High5昆蟲細(xì)胞中獲得表達(dá)，蛋白大小為62kDa。Western blot檢測結(jié)果表明表達(dá)的蛋白可與HBoV4陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，證實(shí)所表達(dá)的蛋白具有良好的抗原性。對裂解后的細(xì)胞上清進(jìn)行了氯化銫密度梯度離心，PBS重懸后負(fù)染電鏡觀察，電鏡下觀察到22nm左右的類似HBoV4的球形粒子，進(jìn)一步證實(shí)病毒樣粒子構(gòu)建成功。然后，利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模表達(dá)了HBoV1-4 VP2蛋白的病毒樣粒子，并利用氯

8、化銫超速離心純化蛋白，SDS-PAGE顯示其大小與預(yù)測一致，純度良好。使用非阻斷和阻斷IgG ELISA，證明其抗原性良好。
　　然后使用純化后的HBoV4重組蛋白初步建立了HBoV4間接IgG ELISA方法。初步確定了臨界值，當(dāng)血清樣品OD492nm≥0.243時，檢測結(jié)果可判定為陽性，OD492nm＜0.243時為陰性。對已有的10個HBoV4陽性樣本進(jìn)行檢測，符合率為100％。在使用HBoV1-3抗原阻斷交叉抗體后，使用H

9、BoV4間接ELISA檢測192份兒童血清樣品，其陽性率為3.6％(7/192)。并針對兔源血清，對已有的HBoV1-4間接IgG ELISA方法進(jìn)行了改良。改良后，兔源血清最佳稀釋度為1∶1000，阻斷抗原最佳濃度為30mg/mL;豬抗兔IgG/HRP的最佳使用濃度為1∶2000。
　　隨后，利用人類細(xì)小病毒B19(B19V)及上述HBoV1-4病毒樣粒子，采用10組不同的組合方式免疫家兔。第一種HBoV或B19V抗原接種60天

10、后，接種第二種HBoV或B19V抗原，并從接種前直到接種后120天期間定期收集血清。通過非阻斷和異源阻斷HBoV IgG ELISA對HBoV1-4 IgG抗體進(jìn)行血清學(xué)分析，結(jié)果表明所有的兔子均表現(xiàn)出明顯的抗體反應(yīng)。B19V并不會與HBoV1產(chǎn)生原始抗原效應(yīng)，同源抗原HBoV1和HBoV2加強(qiáng)免疫后，抗該抗原的IgG抗體水平并未明顯增加。在異源HBoV的組合內(nèi)有一半的兔子顯示出了不同程度的原始抗原效應(yīng)，這與本研究在人類血清學(xué)研究中的得

11、到的結(jié)果一致。對上述表現(xiàn)為不同程度原始抗原效應(yīng)實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行了抗體動力學(xué)分析，并通過第三方HBoV IgG ELISA檢測交叉反應(yīng)抗體的變化水平。對于再次免疫抗原為HBoV1的實(shí)驗(yàn)動物，發(fā)生原始抗原效應(yīng)幾率較大(66％)。而對于再次免疫抗原為HBoV2的實(shí)驗(yàn)動物，發(fā)生原始抗原效應(yīng)幾率較小(25％)。
　　博卡病毒是第一個展現(xiàn)出原始抗原效應(yīng)現(xiàn)象的細(xì)小病毒。本研究結(jié)果為HBoV1-4免疫研究提供了新的方向，并證實(shí)了人類博卡病毒診斷學(xué)的復(fù)