膀胱移行上皮細(xì)胞種植改性脫細(xì)胞小腸粘膜下基質(zhì)在家兔尿道重建中的應(yīng)用.pdf

1、尿道缺損是泌尿外科的最常見的疾病之一，可發(fā)生于先天性疾病如尿道下裂、尿道上裂等疾病，也可以發(fā)生于尿道損傷、感染，常伴有損傷后的尿道纖維化瘢痕狹窄。短段的尿道狹窄也可以通過(guò)尿道擴(kuò)張、尿道狹窄切開及尿道狹窄段切除加端端吻合術(shù)予以治療。然而，長(zhǎng)段的尿道狹窄或者尿道缺損，需要進(jìn)行移植物進(jìn)行修補(bǔ)。目前，臨床上常用的移植物包括舌粘膜、頰粘膜及陰莖皮膚。然而，口腔粘膜的取材會(huì)帶來(lái)一定的并發(fā)癥，如張口困難、感染、潰瘍、麻木、疼痛等。另外，長(zhǎng)段的尿道狹窄

2、術(shù)后易復(fù)發(fā)，對(duì)于該類患者，往往面臨取材來(lái)源不夠。因此，需要尋求更廣泛來(lái)源的尿道替代移植物。
　　組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為尿道重建提供了新的治療途徑。然而，Chapple等最近認(rèn)為在組織工程技術(shù)大規(guī)模的應(yīng)用于臨床之前應(yīng)該繼續(xù)研究以尋找出更加合適的組織工程材料。目前，報(bào)道較多組織工程材料的主要包括化學(xué)合成材料、天然生物基質(zhì)類材料、天然生物材料的提取物，以及不同類材料的聚合物。其中，小腸粘膜下基質(zhì)（SIS）屬天然生物基質(zhì)類材料，具有天

3、然的細(xì)胞與組織兼容性，且含括膠原、纖維連接蛋白、GAG及生長(zhǎng)因子和信號(hào)蛋白等，能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與遷移。但其結(jié)構(gòu)致密，不利于營(yíng)養(yǎng)液的滲透與代謝物質(zhì)的交換。另外，該類基質(zhì)常規(guī)脫細(xì)胞后仍具有少量的異體細(xì)胞核成分的殘余，會(huì)引起宿主的慢性炎癥反應(yīng)。理想的組織工程支架材料應(yīng)該具有三維（3D）多孔結(jié)構(gòu)及最少的異體細(xì)胞核成份的殘余。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)過(guò)氧乙酸氧化SIS制作出具有3D多孔結(jié)構(gòu)的改性SIS，同時(shí)也最大限度地去除了異體的細(xì)胞核成分殘余。我們進(jìn)一步評(píng)價(jià)膀

4、胱移行細(xì)胞種植這種經(jīng)過(guò)氧乙酸（Peracetic acid，PAA）改性的小腸粘膜下基質(zhì)（SIS）在家兔尿道重建中的應(yīng)用效果。本研究共分以下三部分：
　　第一部分：PAA改性脫細(xì)胞SIS基質(zhì)的制備
　　目的：制作出3D多孔的SIS支架材料，并評(píng)估其表征、力學(xué)性能
　　方法：取新鮮的豬小腸組織，機(jī)械方法游離出粘膜下層及漿肌層，去除上皮層，分離出小腸粘膜下基質(zhì)，置入蒸餾水預(yù)脫細(xì)胞處理，PAA改性SIS組加5％過(guò)氧乙酸（PA

5、A），而無(wú)PAA改性組加PBS液，然后兩組均置入1%Triton X-100。最后75%乙醇消毒，無(wú)菌純凈水保存?zhèn)溆?。取材行HE、MASSON染色、掃描電鏡觀察。應(yīng)用密度瓶法測(cè)定兩組基質(zhì)材料的空隙率。取材大小5mm×60mm，使用萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)測(cè)定其力學(xué)性能，包括最大拉長(zhǎng)、最大強(qiáng)度及楊模量大小。統(tǒng)計(jì)分析兩組SIS材料在形態(tài)學(xué)和力學(xué)性能間的差異。
　　結(jié)果：未經(jīng)PAA處理的SIS結(jié)構(gòu)致密，且有少量細(xì)胞成分殘余，而經(jīng)PAA處理的SIS呈3

6、D多孔狀，幾乎沒(méi)有細(xì)胞核成分殘余。 SIS的上皮面電鏡結(jié)果顯示經(jīng)5% PAA處理SIS表面孔徑明顯增加，經(jīng)過(guò)測(cè)量分析后，脫細(xì)胞新鮮SIS的孔徑值為1.75±0.32μm,而經(jīng)過(guò)PAA氧化處理后的SIS孔徑值為5.16±1.83μm，無(wú)PAA處理的SIS空隙率為18.5±2.6%，而經(jīng)過(guò)PAA處理后的SIS空隙率66.8±3.9%，兩者差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。經(jīng)萬(wàn)能拉伸儀測(cè)定，脫細(xì)胞無(wú)PAA處理SIS及經(jīng)PAA處理的SI

7、S的最大拉伸率分別為16.3±1.6%和15.0±1.2%，最大拉伸強(qiáng)度分別為35.1±7.2 Mpa和24.3±5.6 Mpa，楊氏模量分別為150.4±39.2Mp和118.5±28.4Mpa.
　　結(jié)論：經(jīng)PAA改性的后的SIS具有3D多孔狀結(jié)構(gòu)，幾乎無(wú)異體細(xì)胞核成分殘余，且仍能維持一定的機(jī)械性能，可以作為理想的組織工程材料。
　　第二部分：組織工程膀胱移行上皮細(xì)胞-SIS復(fù)合物的體外構(gòu)建
　　目的：體外構(gòu)建膀胱

8、移行上皮細(xì)胞-改性SIS復(fù)合物，觀察其形態(tài)、評(píng)估改性SIS的細(xì)胞兼容性。
　　方法：取成年新西蘭大白兔膀胱壁0.6×0.6 cm，置入PBS液漂洗。將膀胱組織塊置入含有DMEM培養(yǎng)基的pronase E蛋白酶中，消化過(guò)夜，小心刮取膀胱粘膜層移行上皮細(xì)胞。加含有5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)，0.05%胰酶?jìng)鞔?。制作?xì)胞爬片，應(yīng)用抗AE1/AE3抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定。制作PAA改性SIS支架材料和非PAA

9、改性SIS支架材料浸提液，行MTT實(shí)驗(yàn)記錄兩組細(xì)胞生長(zhǎng)的OD值，了解兩組支架材料的細(xì)胞兼容性。收集細(xì)胞并種植于預(yù)先制好的PAA改性 SIS支架材料和非PAA改性的SIS支架材料上，繼續(xù)培養(yǎng)至2周，取材行HE染色、電鏡觀察。利用RT-PCR技術(shù)和Western-blot技術(shù)檢測(cè)Uroplakin基因在UC-經(jīng)PAA改性SIS復(fù)合物的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：膀胱移行上皮細(xì)胞在無(wú)PAA處理SIS及5%PAA處理后SIS浸提液中生長(zhǎng)狀態(tài)良好

10、，且均優(yōu)于單純ECM培養(yǎng)基的趨勢(shì)，但是差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.35）。無(wú)PAA處理SIS組細(xì)胞生長(zhǎng)以單層結(jié)構(gòu)為常見，而在5% PAA處理后SIS組中，細(xì)胞生長(zhǎng)連接成片，形成2-3層的復(fù)層結(jié)構(gòu)。電鏡下，無(wú)PAA處理SIS上細(xì)胞呈多角形，扁平狀，伸出偽足，緊密貼附于支架材料上。而在5% PAA處理SIS支架上，細(xì)胞分布更加緊密，相互融合呈多層面三維立體結(jié)構(gòu)，表層細(xì)胞多呈圓形、橢圓形及立方形。經(jīng)PAA改性SIS-UC復(fù)合物較無(wú)PAA改性-

11、UC復(fù)合物高表達(dá)Uroplakin基因。
　　結(jié)論：采用酶消化法聯(lián)合機(jī)械的刮擦法能分離培養(yǎng)具有活性的膀胱移行上皮細(xì)胞，陽(yáng)性表達(dá)AE1/AE3。未經(jīng)PAA處理的脫細(xì)胞SIS與經(jīng)5% PAA改性處理SIS支架材料與膀胱移行上皮細(xì)胞均具有良好的細(xì)胞兼容性。經(jīng)5% PAA改性處理SIS能更好的促進(jìn)細(xì)胞在支架材料上生長(zhǎng)并形成復(fù)層結(jié)構(gòu)，且能促進(jìn)膀胱移行上皮向終末分化。
　　第三部分：組織工程膀胱移行上皮-SIS復(fù)合物修補(bǔ)家兔尿道缺損模型

12、的建立與重建效果觀察
　　目的：觀察組織工程膀胱移行上皮-SIS復(fù)合物修補(bǔ)家兔尿道缺損的效果
　　方法：健康成年新西蘭家兔18只，分成三組，膀胱移行上皮細(xì)胞種植PAA改性的SIS支架組、膀胱移行細(xì)胞種植無(wú)PAA改性的SIS材料組，無(wú)膀胱上皮細(xì)胞種植的經(jīng)PAA改性SIS組，每組各6只。按照第二部分的方法，構(gòu)建組織工程膀胱上皮細(xì)胞-SIS復(fù)合物。再次麻醉家兔，游離腹側(cè)尿道海綿體至粘膜層，建立家兔尿道粘膜缺損模型1.5×0.8cm

13、2，修剪支架材料大小為1.7×1cm2，以補(bǔ)片的方式進(jìn)行修補(bǔ)。術(shù)后抗感染、尿管沖洗，手術(shù)后半年行尿道造影檢查，大體病理觀察及HE、MASSON、免疫組化檢測(cè)。
　　結(jié)果：上皮細(xì)胞-5% PAA改性SIS復(fù)合物組均存活，尿道通暢,再生尿道粘膜完全再生。病理見復(fù)層移行上皮、上皮下平滑肌增生，血管增生。而上皮細(xì)胞-無(wú)PAA改性SIS復(fù)合物組，有尿瘺發(fā)生，再生尿道粘膜不完整。病理見上皮不規(guī)則，及慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。單純PAA改性SIS組有尿