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文檔簡介
1、對瓊膠酶的研究是目前海洋分子生物學(xué)研究的重點內(nèi)容之一.在瓊膠酶的研究工作中,該實驗室做了重要的工作:從海洋細菌內(nèi)成功克隆并表達了兩個β-瓊膠酶基因,命名為β-瓊膠酶A和β-瓊膠酶B.隨著對這兩個β-瓊膠酶的功能與酶學(xué)性質(zhì)研究的進行,越來越多的工作與酶的結(jié)構(gòu)密切相關(guān).酶的結(jié)構(gòu)獲得可以通過實驗手段,也可以通過結(jié)構(gòu)預(yù)測的手段.生物信息學(xué)方法在獲得結(jié)構(gòu)模型、指導(dǎo)生物學(xué)實驗上具有時效性和準確性.因此該論文使用生物信息學(xué)軟件對β-瓊膠酶A、B進行了
2、研究,根據(jù)生物信息學(xué)研究給出的結(jié)果設(shè)計分子生物學(xué)實驗.在實驗的過程中,使用了多種生物信息學(xué)方法,包括序列同源性搜索、模體搜索、同源模建、家族分析、反向折疊等等,構(gòu)建了多種酶的結(jié)構(gòu)模型,使用結(jié)構(gòu)分析軟件分析蛋白模型的可靠性,同時使用了全柔性分子對接和自動分子對接的軟件進行了復(fù)合物的研究和結(jié)合腔的分析,最終獲得了指導(dǎo)分子生物學(xué)實驗的信息,并進行了分子生物學(xué)實驗的驗證.以下是對結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建和生物學(xué)實驗工作的簡單介紹:該論文使用序列分析和模體分
3、析工具對β-瓊膠酶A進行了全面的分析.根據(jù)同源性高的模板,使用多種同源模建的方法構(gòu)建了目標蛋白的結(jié)構(gòu),對蛋白的結(jié)構(gòu)進行了合理性評價,以最優(yōu)的結(jié)構(gòu)構(gòu)建了完整的β-瓊膠酶A模型.使用序列相似性搜索、模體搜索對β-瓊膠酶B進行分析.序列相似性搜索、模體搜索顯示β-瓊膠酶B是一個結(jié)構(gòu)獨特的酶,普通的同源建模方法無法完成結(jié)構(gòu)模鍵,更無法研究結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系.使用遠程同源識別和穿線法在低序列同源的條件下獲得模型結(jié)構(gòu).根據(jù)遠程同源識別和穿線法給出的序
4、列對位的信息,以及模板分子所歸屬的家族信息,確定以下的氨基酸D217、D221、D236、D245、D288是β-瓊膠酶B潛在的催化位點.用大引物PCR法對β-瓊膠酶A進行氨基酸定點突變,構(gòu)建了兩個突變體E124A和E129A,經(jīng)過表達和酶活測定,結(jié)果表明E124A和E129A的突變導(dǎo)致了β-瓊膠酶A活性的喪失,證實E124和E129為瓊膠降解酶的活性中心的推測是正確的.結(jié)合分子模建和蛋白質(zhì)工程手段,得到了β-瓊膠酶A催化中心的信息,這
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