牽張應(yīng)變對培養(yǎng)的小鼠小腸ICCs起搏活動(dòng)的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICCs)是胃腸道的起搏細(xì)胞,具有產(chǎn)生節(jié)律性慢波、傳遞電信號及調(diào)節(jié)慢波傳遞等功能。牽張應(yīng)變是胃腸平滑肌在消化過程中常見的生理性或病理性刺激。蠕動(dòng)的食物或食糜對胃腸的擴(kuò)張作用直接對平滑肌細(xì)胞及ICCs產(chǎn)生牽拉刺激,從而改變胃腸蠕動(dòng)功能。胃腸道平滑肌的牽張應(yīng)變刺激一般引起被牽拉肌肉的收縮活動(dòng)增強(qiáng),發(fā)生這種改變的機(jī)制有兩種,即神經(jīng)源性機(jī)制和肌源性機(jī)制,目前神經(jīng)源性機(jī)制已比較明確,但關(guān)于肌源性機(jī)制的研究尚存在需要進(jìn)一步解決的

2、科學(xué)問題。研究表明,肌源性機(jī)制與平滑肌細(xì)胞膜離子通道活動(dòng)有關(guān),如細(xì)胞膜被牽張變形可以激活某些離子通道。然而,ICCs作為胃腸運(yùn)動(dòng)調(diào)控中的熱點(diǎn)細(xì)胞,其起搏功能與牽張應(yīng)變之間的關(guān)系研究甚少。
　　 為了明確牽張應(yīng)變對ICCs起搏活動(dòng)的影響及機(jī)制,我們采用膜片鉗、細(xì)胞外記錄以及鈣熒光成像技術(shù)等手段,探討了體外培養(yǎng)的小鼠小腸ICCs起搏電流特性、產(chǎn)生機(jī)制以及牽張應(yīng)變對ICCs起搏電流的影響。
　　 研究結(jié)果如下:
　　

3、一、ICCs起搏電流的電生理學(xué)特性
　　 1.胞內(nèi)外鈣離子的作用:采用膜片鉗傳統(tǒng)全細(xì)胞記錄模式,發(fā)現(xiàn)胞外無鈣灌流液使ICCs起搏電流消失；高濃度(10 mmol/L)EGTA使胞內(nèi)鈣離子濃度降低或采用單通道記錄模式直接降低胞內(nèi)鈣離子濃度,ICCs起搏電流活動(dòng)增強(qiáng)；FCCP(線粒體的解偶聯(lián)劑)造成胞內(nèi)鈣離子濃度升高使ICCs起搏電流逐漸被抑制。
　　 2.鈣庫的作用:IP3受體敏感鈣庫的阻斷劑2-APB阻斷起搏電流；Rya

4、nodine受體敏感的鈣庫阻斷劑Ryanodine不影響起搏電流；胞內(nèi)鈣庫的鈣泵抑制劑Thapsigargin阻斷起搏電流。
　　 3.起搏電流成分:用NMDG+(NMDG+不能通過離子通道)取代細(xì)胞外灌流液中的Na+離子,起搏電流消失；非選擇性陽離子通道阻斷劑Gd3+阻斷ICCs起搏電流。
　　 4.細(xì)胞骨架微絲的作用:Cytochalasin-B(微絲的解聚劑)顯著抑制起搏電流和鈣振蕩的幅度和頻率,但基礎(chǔ)鈣水平未受C

5、ytochalasin-B影響；Phalloidin(微絲的穩(wěn)定劑)顯著增強(qiáng)起搏電流和鈣振蕩的幅度和頻率,但基礎(chǔ)鈣水平未受Phalloidin影響；2-APB阻斷Phalloidin對起搏電流和鈣振蕩的增強(qiáng)作用；而Ryanodine不能阻斷Phalloidin對起搏電流和鈣振蕩的增強(qiáng)作用。
　　 二、牽張應(yīng)變對ICCs起搏功能的影響及其機(jī)制研究
　　 1.在組織水平,利用細(xì)胞外記錄方法記錄了小腸的慢波和快波。牽拉小腸壁引

6、起小腸慢波幅度、快波頻率和幅度均顯著增加,但小腸慢波頻率不受影響。
　　 2.在傳統(tǒng)全細(xì)胞電壓鉗和電流鉗模式下,低滲誘導(dǎo)的細(xì)胞膜牽張(Membrane stretch-induced by hyposmotic cell swelling,MSHC)激活一種持續(xù)的內(nèi)向鉗制電流,使ICCs靜息電位發(fā)生去極化,并降低自發(fā)性起搏電位和電流的幅度,但對起搏電位和電流的頻率無顯著改變。
　　 3.胞內(nèi)外鈣離子的作用:采用膜片鉗傳統(tǒng)

7、全細(xì)胞記錄模式,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外無鈣灌流液阻斷MSHC誘導(dǎo)的ICCs內(nèi)向鉗制電流；高濃度(10mmol/L)EGTA降低胞內(nèi)鈣離子濃度,對MSHC激活的ICCs內(nèi)向鉗制電流無影響；FCCP(線粒體的解偶聯(lián)劑)造成胞內(nèi)鈣離子濃度升高,阻斷MSHC激活的內(nèi)向鉗制電流。
　　 4.鈣熒光成像技術(shù)顯示,MSHC顯著增高ICCs胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣水平,并增加ICCs自發(fā)性鈣振蕩的幅度,但鈣振蕩頻率未見顯著改變。
　　 5.鈣庫的作用:IP3受體

8、敏感的鈣庫阻斷劑2-APB對MSHC誘導(dǎo)的持續(xù)性內(nèi)向鉗制電流無阻斷作用；Ryanodine受體敏感的鈣庫阻斷劑Ryanodine和胞內(nèi)鈣庫的鈣泵抑制劑Thapsigargin完全阻斷MSHC誘導(dǎo)的內(nèi)向鉗制電流。通過鈣熒光成像實(shí)驗(yàn)得到相似結(jié)果,即Ryanodine阻斷MSHC引起的胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣濃度增高的作用,而2-APB未能阻斷MSHC對胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣濃度和鈣振蕩幅度的增強(qiáng)作用。
　　 6.MSHC誘導(dǎo)的內(nèi)向鉗制電流成分:用NMDG+(

9、NMDG+不能通過離子通道)來取代細(xì)胞外灌流液中的Na+離子,MSHC不能再誘導(dǎo)出內(nèi)向鉗制電流；非選擇性陽離子通道阻斷劑Gd3+抑制MSHC激活的內(nèi)向鉗制電流。
　　 7.細(xì)胞骨架微絲的作用:Cytochalasin-B阻斷MSHC激活的內(nèi)向鉗制電流和鈣振蕩增強(qiáng)作用,并阻斷MSHC對基礎(chǔ)鈣水平增加的作用；Phalloidin(微絲的穩(wěn)定劑)不阻斷MSHC誘發(fā)的內(nèi)向電流和鈣振蕩增強(qiáng)作用,且不能阻斷MSHC對基礎(chǔ)鈣水平的增加作用。<

10、br>　　 以上結(jié)果提示:①ICCs起搏電流的產(chǎn)生與低鈣敏感的非選擇性陽離子通道開放有關(guān),IP3受體敏感的鈣庫釋放鈣離子(IICR)是起搏電流產(chǎn)生的關(guān)鍵因素；②細(xì)胞骨架微絲參與ICCs起搏活動(dòng)的調(diào)節(jié),與IICR有關(guān)；③牽張應(yīng)變引起平滑肌收縮增強(qiáng)的機(jī)制與慢波幅度增強(qiáng)有關(guān)；④牽張應(yīng)變增強(qiáng)小腸ICCs起搏電活動(dòng),其機(jī)制與非選擇性陽離子通道開放及Ryanodine受體敏感的鈣庫釋放鈣離子(CICR)有關(guān)；⑤細(xì)胞骨架微絲參與牽張應(yīng)變增強(qiáng)小腸IC