巨噬細(xì)胞活化對(duì)NEC腸道ICCs表型改變的影響及其機(jī)理研究.pdf

1、第一部分NEC患兒腸道巨噬細(xì)胞的活化、TNF-α的表達(dá)及ICCs的表型改變
　　目的：研究NEC患兒腸道巨噬細(xì)胞的活化、TNF-α的表達(dá)及ICCs的表型改變情況，探究其在NEC發(fā)病中的作用。
　　方法：采用HE染色、免疫熒光雙染、免疫組化、Westen blot及RT-PCR等技術(shù)對(duì)正常小腸組織和NEC小腸組織進(jìn)行對(duì)比研究。
　　結(jié)果：HE染色—正常小腸絨毛排列整齊，腸壁無(wú)水腫及充血，而NEC患兒小腸絨毛壞死，腸壁充血

2、，腸壁有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫熒光雙染—正常小腸有少量 CD68陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞表達(dá)，未見(jiàn)巨噬細(xì)胞活化，而NEC腸道有大量M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)。免疫組化和western blot—NEC組腸道TNF-α蛋白表達(dá)明顯高于正常組，且TNF-α陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域主要分布于粘膜層以及環(huán)行肌和縱行肌之間。c-kit的免疫組化染色可見(jiàn)正常小腸ICCs主要分布于環(huán)行肌和縱行肌之間、環(huán)行肌內(nèi)和縱行肌內(nèi)，NEC組小腸未見(jiàn) c-kit陽(yáng)性表達(dá)

3、。RT-PCR結(jié)果與蛋白表達(dá)結(jié)果一致，可見(jiàn)NEC組小腸CD68、iNOS及TNF-αmRNA的表達(dá)明顯高于正常組，而c-kit mRNA的表達(dá)明顯低于正常組。
　　結(jié)論：NEC腸道有大量M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，TNF-α表達(dá)顯著升高。在NEC發(fā)病過(guò)程中，腸道ICCs發(fā)生表型改變，這可能與腸道運(yùn)動(dòng)功能紊亂有關(guān)。
　　第二部分巨噬細(xì)胞對(duì)NEC小鼠腸道ICCs表型改變的影響
　　目的：進(jìn)一步在動(dòng)物模型中研究NEC腸道巨噬細(xì)胞活化

4、、TNF-α表達(dá)及ICCs的表型改變情況，研究巨噬細(xì)胞對(duì)NEC腸道TNF-α表達(dá)及ICCs表型改變的影響。
　　方法：新生鼠隨機(jī)分為4組：正常組，未進(jìn)行缺氧、注射用藥及冷刺激；NEC組，采用缺氧冷刺激的方式制作NEC動(dòng)物模型；NEC+NS組，在NEC模型制作前24小時(shí)腹腔注射生理鹽水60μl；NEC+CL組，在NEC模型制作前24小時(shí)腹腔注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體溶液60μl。分別于實(shí)驗(yàn)第2天（NEC早期）、第4天（NEC進(jìn)展期）、第8

5、天（NEC恢復(fù)期）及第15天（腸道恢復(fù)）提取小鼠小腸組織，行HE染色對(duì)腸道進(jìn)行病理評(píng)分，觀察各組 NEC發(fā)生率，采用免疫熒光雙染、免疫組化、Westen blot及RT-PCR等技術(shù)檢測(cè)各組腸道巨噬細(xì)胞的活化、TNF-α的表達(dá)及ICCs的表型改變情況。
　　結(jié)果：氯膦酸二鈉脂質(zhì)體在NEC早期和NEC恢復(fù)期能明顯減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)，但在NEC進(jìn)展期這種抑制作用減弱。在NEC早期M1型巨噬細(xì)胞低表達(dá)能明顯減輕NEC腸道的損傷，降

6、低NEC發(fā)生率和TNF-α的表達(dá)，并能減輕腸道ICCs的損傷。在NEC恢復(fù)期M1型巨噬細(xì)胞低表達(dá)能降低TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)腸道組織修復(fù)及ICCs表型的恢復(fù)。
　　結(jié)論:M1型巨噬細(xì)胞在NEC腸道的炎性損傷中具有重要作用，抑制M1型巨噬細(xì)胞不僅能降低TNF-α的表達(dá)，減輕腸道的炎性損傷和ICCs的損傷，還能在恢復(fù)期促進(jìn)腸道組織的修復(fù)及ICCs表型的恢復(fù)。
　　第三部分TNF-α對(duì)腸道ICCs表型改變的影響及其機(jī)理研究

7、　　目的：研究TNF-α抑制c-kit的表達(dá)，導(dǎo)致ICCs發(fā)生表型改變的機(jī)制。
　　方法：出生24小時(shí)內(nèi)將B6小鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組，對(duì)腸管進(jìn)行組織培養(yǎng)，培養(yǎng)液中未加TNF-α；空白對(duì)照組，未培養(yǎng)的腸管；TNF-α組，對(duì)腸管進(jìn)行組織培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入不同濃度的TNF-α；miR-222拮抗組，新生小鼠腹腔注射miR-222拮抗劑24小時(shí)后對(duì)腸管進(jìn)行組織培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入不同濃度的TNF-α。小腸組織培養(yǎng)48小時(shí)后采用RT-P

8、CR及Western blot技術(shù)檢測(cè)腸組織中miRNA-222、c-kit mRNA及c-kit蛋白的表達(dá)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)鑒定c-kit是否為miRNA-222的靶基因。
　　結(jié)果：當(dāng)培養(yǎng)液中TNF-α濃度在100-500ng/ml時(shí)，miRNA-222的表達(dá)上調(diào)并抑制c-kit mRNA和蛋白的表達(dá)。使用miR-222拮抗劑之后，在培養(yǎng)液TNF-α濃度在100-200ng/ml時(shí)，可逆轉(zhuǎn)這種抑制作用，但是當(dāng)培養(yǎng)液中TNF-α濃