黃鱔性別相關(guān)基因在不同組織甲基化的分析.pdf

1、DNA甲基化修飾是真核生物最常見的表觀遺傳現(xiàn)象之一，是一種可逆的過程，能夠直接影響到基因的活性。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明DNA甲基化在水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著舉足輕重的作用。因此，研究DNA甲基化修飾是從分子學(xué)角度研究水產(chǎn)動(dòng)物各種生理現(xiàn)象的關(guān)鍵。黃鱔具有性逆轉(zhuǎn)的特點(diǎn)，對(duì)于黃鱔的性別相關(guān)基因我們選擇了Dmrt基因、Sox基因和Vasa基因。這三組基因已經(jīng)證實(shí)在魚類雌雄性腺中存在表達(dá)差異。黃鱔的Dmrt2、Dmrt3、Dmrt4基因編碼的mRNA

2、全長(zhǎng)分別為1680bp、1413bp和1772bp，分別編碼526、470、420個(gè)氨基酸;而Sox9a1和Sox17基因的mRNA全長(zhǎng)分別為1625bp和1775bp，編碼氨基酸數(shù)量為482和399個(gè);Vasa基因的mRNA全長(zhǎng)2267bp，編碼氨基酸618個(gè)。由于基因甲基化的開啟或關(guān)閉先于基因表達(dá)產(chǎn)生差異，我們通過比較這些基因的甲基化在雌雄性腺以及其他組織中甲基化狀態(tài)就可以簡(jiǎn)單了解這些基因的開關(guān)狀況以及合適開關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)用

3、甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶HpaⅡ酶切黃鱔的雌雄性腺以及其他組織的DNA后，找到合適的擴(kuò)增條件，根據(jù)已知的mRNA序列分別設(shè)計(jì)相關(guān)引物擴(kuò)增各酶切產(chǎn)物的Vasa基因、Sox基因（Sox9a1、Sox17）和Dmrt基因(Dmrt2、Dmrt3、Dmrt4)，同時(shí)與未酶切的對(duì)照組進(jìn)行比較，推測(cè)出各組織相關(guān)基因序列中可能發(fā)生甲基化的位點(diǎn)，分析差異條帶，并對(duì)差異條帶進(jìn)行驗(yàn)證，最后通過對(duì)比基因序列得到差異位點(diǎn)，為后續(xù)研究尋找合適的擴(kuò)增條件，也為黃鱔

4、性別調(diào)控的相關(guān)研究提供一種分子學(xué)角度的方法。
　　通過本實(shí)驗(yàn)的研究，發(fā)現(xiàn)不同基因的甲基化狀態(tài)在不同組織中是存在差異的:Dmrt3-FR2的擴(kuò)增序列在精巢中是去甲基化的，而在卵巢和其他組織中卻為甲基化狀態(tài)，所以此位點(diǎn)的甲基化差異很可能與性別調(diào)控相關(guān);Dmrt4-FR2、Dmrt4-FR3、Sox9a1-FR2、Sox9a1-FR4、Sox17-FR1和Vasa-FR5基因的擴(kuò)增序列中，各組織無(wú)差異性，皆存在甲基化位點(diǎn)，而其余序列都為