MiR--499--5p介導(dǎo)冠心病炎癥機(jī)制初探及中醫(yī)證型相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　各種研究表明，miR-499-5p與心血管疾病也具有十分密切的關(guān)系，尤其是在冠心病發(fā)展過程中，血管內(nèi)皮損傷時(shí)，miR-499-5p的表達(dá)水平特異性增高。因此本研究通過分離原代細(xì)胞技術(shù)，以人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞作為研究材料，探討了miR-499-5p與人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的相關(guān)性、miR-499-5p與人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡的相關(guān)性以及miR-499-5p的表達(dá)與冠心病患者中醫(yī)證型分布的相關(guān)性。

2、>　　方法:
　　1、原代人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離、純化與鑒定
　　2、炎癥性血管內(nèi)皮細(xì)胞模型的建立
　　3、不同炎癥反應(yīng)程度血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-499-5p的表達(dá)差異
　　4、不同miR-499-5p的表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響
　　5、MiR-499-5p調(diào)控SOX6蛋白介導(dǎo)炎癥反應(yīng)
　　6、MiR-499-5p表達(dá)水平與患者中醫(yī)證型的相關(guān)性研究
　　6.1、病例選擇:以2016年1至2

3、017年1月入住于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科住院病區(qū)患者為研究對(duì)象，納入冠心病患者人數(shù)170例，參考2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)編輯的2015年《冠心病診斷和治療指南》，既往行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)明確診斷為冠心病，男90例，女80例;平均年齡(49.6±15.5)歲;平均病程(6.3±1.7)年，均排除嚴(yán)重肝腎、造血系統(tǒng)疾病等原發(fā)性疾病、腫瘤、慢性感染、腦血管疾病、近期手術(shù)及創(chuàng)傷者、重度神經(jīng)官能癥者、精神異常者;排除中醫(yī)辨證兩

4、型兼見無主次之分及證型復(fù)雜者。另設(shè)健康人對(duì)照組30例，均排除冠心病患者，男15例，女15例;平均年齡(47.6±12.5)歲。兩組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。
　　6.2、冠心病組病人按照2012年《中藥、天然藥物治療冠心病心絞痛臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行中醫(yī)辨證分型，其中心血瘀阻型患者為77例、痰阻心脈型患者為21例、氣虛血瘀型患者為45例、心腎陰虛型患者為27例、氣滯血瘀型0例、陰寒凝滯型0例、氣陰兩虛型0例、

5、陽氣虛衰型0例，另設(shè)排除冠心病健康人志愿者30例。各證型間一般資料及可能影響miR-499濃度的因素(吸煙、高血壓病及心衰等)經(jīng)方差檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.3、采用逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)及熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同中醫(yī)證型分布的冠心病人與正常對(duì)照組的miR-499-5p的表達(dá)水平;
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　使用Alphaview SA331軟件進(jìn)行曝光、圖像攝影，灰度獲取;應(yīng)用SPSS20.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;計(jì)量資料

6、以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示，所有數(shù)據(jù)均滿足方差齊性，P＜0.05;兩組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P＜0.05表示具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;多重比較采用兩兩對(duì)比法;顯著性水準(zhǔn)α取0.05。
　　結(jié)果：
　　1、炎癥性血管內(nèi)皮細(xì)胞模型的建立
　　1.1、采用TNF-α炎癥因子刺激法對(duì)人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行炎癥刺激，建立炎癥性血管內(nèi)皮細(xì)胞模型后，MTT法檢測(cè)模型組與對(duì)照組細(xì)胞炎癥程度的差異，結(jié)果表明TNF-α炎癥因子刺激組細(xì)胞炎癥

7、程度明顯上升;
　　1.2、采用MTT技術(shù)繪制人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞曲線，探究炎癥反應(yīng)對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明TNF-α炎癥因子刺激后的細(xì)胞細(xì)胞增殖速度較對(duì)照組下降。
　　2、不同炎癥反應(yīng)程度血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-499-5p的表達(dá)差異
　　2.1、將人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分為對(duì)照組與炎癥組，對(duì)照組細(xì)胞為PBS空白處理的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，炎癥組為高炎癥人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞模型;
　　2.2、與正常對(duì)照組

8、相比較，高炎癥反應(yīng)組細(xì)胞其miR-499-5p的表達(dá)上調(diào)。
　　3、不同miR-499-5p的表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響
　　3.1、使用miR-499-5p mimic體外miRNA模擬物技術(shù)，人為上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-499-5p的表達(dá)水平，建立miR-499-5p高表達(dá)細(xì)胞組，Q-RT-PCR檢測(cè)表明該模型具有高的miR-499-5p表達(dá);
　　3.2、使用miR-499-5p inhibitor體外miRNA抑制劑

9、技術(shù)，人為下調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-499-5p的表達(dá)水平，建立miR-499-5p低表達(dá)細(xì)胞組，Q-RT-PCR檢測(cè)表明該模型具有低的miR-499-5p表達(dá);
　　3.3、采用MTT技術(shù)繪制人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞曲線，結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，高miR-499-5p表達(dá)組細(xì)胞細(xì)胞增殖水平下降;低miR-499-5p表達(dá)組細(xì)胞細(xì)胞增殖水平上升;
　　3.4、采用RTCA細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)，結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，

10、高miR-499-5p表達(dá)組細(xì)胞細(xì)胞增殖率下降;低miR-499-5p表達(dá)組細(xì)胞細(xì)胞增殖率增加;
　　3.5、采用流式細(xì)胞技術(shù)，結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，高miR-499-5p表達(dá)組細(xì)胞細(xì)胞凋亡率增加;低miR-499-5p表達(dá)組細(xì)胞細(xì)胞凋亡率下降;
　　3.6、采用DAPI染色實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，高miR-499-5p表達(dá)組細(xì)胞細(xì)胞凋亡率增加;低miR-499-5p表達(dá)組細(xì)胞細(xì)胞凋亡率下降;
　　4、

11、MiR-499-5p調(diào)控SOX6蛋白介導(dǎo)炎癥反應(yīng)
　　4.1、信息生物學(xué)技術(shù)及RNA庫技術(shù)，篩選與miR-499-5p具有吻合端的相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示SOX6蛋白啟動(dòng)子序列具有與miR-499-5p相似的堿基排列順序，提示SOX6蛋白可能受miR-499-5p調(diào)控;
　　4.2、使用miR-499-5p mimic體外miRNA模擬物技術(shù)，人為上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-499-5p的表達(dá)水平，建立miR-499-5p高表達(dá)細(xì)胞組;Q-

12、RT-PCR檢測(cè)表明該模型具有高的miR-499-5p表達(dá);
　　4.3、使用miR-499-5p inhibitor體外miRNA抑制劑技術(shù)，人為下調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-499-5p的表達(dá)水平，建立miR-499-5p低表達(dá)細(xì)胞組;Q-RT-PCR檢測(cè)表明該模型具有低的miR-499-5p表達(dá);
　　4.4、采用免疫蛋白印記技術(shù)，結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相對(duì)比，miR-499-5p高表達(dá)組細(xì)胞，SOX6蛋白表達(dá)下調(diào);miR-499-

13、5p低表達(dá)組細(xì)胞，SOX6蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　5、MiR-499-5p表達(dá)水平與患者中醫(yī)證型的相關(guān)性研究
　　5.1、本研究組冠心病患者中醫(yī)證型分布規(guī)律為心血瘀阻型、氣虛血瘀型、痰阻心脈型、心腎陰虛型、氣滯血瘀型、陰寒凝滯型、氣陰兩虛型、陽氣虛衰型。
　　5.2、各組miR-499表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，心血瘀阻型、痰阻心脈型、氣虛血瘀型、心腎陰虛型miR-499表達(dá)水平較空白對(duì)照組上調(diào)(P＜0.05)，心血瘀阻型

14、miR-499含量較痰阻心脈型、氣虛血瘀型、心腎陰虛型上調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、MiR-499-5p的高表達(dá)能明顯降低人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖率，影響細(xì)胞生長(zhǎng);相反MiR-499-5p的低表達(dá)能明提高人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖率，較低細(xì)胞凋亡率;
　　2、人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-499-5p的表達(dá)與SOX蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miR-499-5p可能調(diào)控SOX6蛋白的表達(dá)間接參與炎癥