十字花科黑腐病菌小RNA鑒定及表達分析.pdf

1、細菌小RNA(smallRNAs，sRNAs)不同于傳統(tǒng)認識的tRNA、mRNA和rRNA，是一類主要位于基因間區(qū)，長度介于50-500nt之間，作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子執(zhí)行多種功能的RNA分子。這類RNA分子廣泛分布于各種細菌中，通過堿基互補的形式與靶標mRNA結(jié)合而調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性和（或）翻譯，并因此影響細菌的環(huán)境應(yīng)答、毒力調(diào)節(jié)等生命活動。目前，細菌小RNA的鑒定和功能研究已受到廣泛關(guān)注，但系統(tǒng)鑒定的較少，特別是在植物病原菌中。本研究

2、運用直接測序法對植物病原菌十字花科黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，簡稱Xcc)8004菌株的小RNA進行了系統(tǒng)鑒定，并在不同條件檢驗了小RNA的表達情況。
　　 首先，我們將Xcc8004和8004△hrpG在MMX培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用酸酚法提取總RNA，直接送去華大基因公司進行Solexa測序。根據(jù)測序結(jié)果，我們對Xcc8004和8004△hrpG50-500nt的RNA

3、進行了轉(zhuǎn)錄譜分析。結(jié)果顯示：Xcc8004的Solexareads數(shù)為10105194，其中1396247(13.8％)對上基因區(qū)，8708947(86.2％)對上基因間區(qū)；8004△hrpG的Solexareads數(shù)為12471847，其中1581015(12.7％)對上基因區(qū)，10890832(87.3％)對上基因間區(qū)。我們從獲得的轉(zhuǎn)錄譜篩選出大量的候選小RNA，并依次進行驗證。
　　 本研究從所有候選小RNA中選出5個進行

4、northern雜交驗證，結(jié)果顯示，有兩個候選小RNA出現(xiàn)清晰的大小位于100-200nt之間的雜交主帶，與轉(zhuǎn)錄譜的長度吻合，證明這兩個是真正的小RNA，命名為sRNA-Xcc5和sRNA-Xcc6。接著，我們運用在線軟件sFold和sRNATarget對sRNA-Xcc5和sRNA-Xcc6進行二級結(jié)構(gòu)和靶標的預(yù)測，共獲得329個sRNA-Xcc5的候選靶標，其中有25個是已知的致病基因；900個sRNA-Xcc6的候選靶標，有62個

5、是已知的致病基因，表明sRNA-Xcc5和sRNA-Xcc6可能與Xcc的致病性相關(guān)。
　　 為了檢測sR.NA-Xcc5和sRNA-Xcc6在不同條件下的表達，我們在不同培養(yǎng)條件、不同pH脅迫、不同生長時期進行了檢驗。結(jié)果顯示，8004WT和DM2515中小RNA在不同的NYG、XVM2和MMX的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)至對數(shù)期，sRNA-Xcc5只在MMX培養(yǎng)時表達，在NYG、XVM2培養(yǎng)時不表達；sRNA-Xcc6在各種培養(yǎng)基中均

6、表達，但在MMX中表達量最高，說明sRNA-Xcc5和sRNA-Xcc6的表達受培養(yǎng)條件的影響，且在此條件下，hfq蛋白不參與兩個小RNA的表達。在不同pH脅迫的條件下，pH=5.5時sRNA-Xcc5和sRNA-Xcc6的表達豐度最大；在pH=6.5時，兩個小RNA均表達，但表達豐度比正常值(pH=6.0)時低；pH=8.5時，sRNA-Xcc5不表達，sRNA-Xcc6仍能表達，但豐度低于正常值。在不同生長時期，sRNA-Xcc5和

7、sRNA-Xcc6在8004野生型、hfq蛋白缺失時及hrpG缺失時均能表達，且表達差異不大，說明在此條件下sRNA-Xcc5和sRNA-Xcc6的表達不受生長時期的影響，不依賴于hfq蛋白，且不受hrpG的調(diào)控，與Xcc的三型分泌系統(tǒng)關(guān)聯(lián)性不大。
　　 綜上所述，我們用Solexa測序?qū)cc8004的小RNA進行了系統(tǒng)鑒定，率先獲得兩個小RNA，并對這兩個小RNA在不同條件下的表達進行了檢測，為在全基因組范圍內(nèi)鑒定Xcc80