擬南芥受十字花科黑腐病菌誘導(dǎo)的microRNA的鑒定.pdf

1、十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc)能在全球范圍內(nèi)侵染十字花科植物，寄主包括甘藍(lán)、蘿卜、花椰菜、白菜、油菜、芥菜等作物以及模式生物擬南芥(Arabidopsis thanliana)，引起黑腐病。擬南芥和Xcc都是模式生物，二者的相互作用系統(tǒng)是研究病原細(xì)菌與寄主植物相互作用的致病分子機(jī)理的重要模式之一。
　　 長期以來，在對植物和病原菌的相互作用過程中的抗病機(jī)理的研

2、究中，人們注意力集中在對抗性蛋白的研究中。近年來，越來越多的證據(jù)表明內(nèi)源性小RNA包括miRNA在植物防衛(wèi)病原微生物入侵的防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用。目前在多個(gè)寄主與病原微生物相互作用過程中發(fā)現(xiàn)受病原微生物誘導(dǎo)的miRNA參與植物防衛(wèi)反應(yīng)，這些病原微生物包括病毒、真菌、細(xì)菌、線蟲和植食性昆蟲。但是受病原細(xì)菌誘導(dǎo)的miRNA目前只在擬南芥-pst DC3000、煙草-根癌農(nóng)桿菌、豆科植物-根瘤菌相互作用過程中發(fā)現(xiàn)，在其他植物與病原細(xì)菌的相互

3、作用中還沒有發(fā)現(xiàn)參與防衛(wèi)反應(yīng)的miRNA，包括擬南芥與Xcc的互作過程中是否有miRNA參與，目前還未見報(bào)道。
　　 為了鑒定擬南芥中受十字花科黑腐病菌誘導(dǎo)的miRNAs，研究miRNAs在抗Xcc的防衛(wèi)反應(yīng)中的作用，我們構(gòu)建了擬南芥受十字花科黑腐病菌Xcc8004、Xcc8004△hrcV和丁香假單胞菌pst DC 3000誘導(dǎo)14小時(shí)和用無菌水作對照組的小RNA文庫，利用Illumina/Solexa測序技術(shù)對8個(gè)擬南芥小R

4、NA文庫進(jìn)行測序，并對差異表達(dá)miRNA和新發(fā)現(xiàn)miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析。測序初步數(shù)據(jù)分析顯示ath-miR319a、ath-miR776、ath-miR172c、ath-miR827表達(dá)差異顯著，Northern blot驗(yàn)證結(jié)果顯示ath-miR319a在對照組中只顯示很微弱的條帶，表達(dá)量較低，而受Xcc8004誘導(dǎo)14小時(shí)后的條帶的亮度明顯上升，表明其受誘導(dǎo)表達(dá)；但是受pst DC3000誘導(dǎo)14小時(shí)沒有條帶，說明其表達(dá)受ps

5、t DC3000抑制。相似的，ath-miR776在對照組中只顯示出微弱的條帶；受Xcc8004誘導(dǎo)14小時(shí)的條帶亮度明顯增加，表達(dá)也受誘導(dǎo)；受pst DC3000誘導(dǎo)14小時(shí)的條帶亮度和對照組基本沒有變化。目前對新發(fā)現(xiàn)小RNA的生物信息學(xué)分析得到311個(gè)具有典型二級結(jié)構(gòu)前體的候選miRNA，其中126個(gè)為新發(fā)現(xiàn)候選miRNA。
　　 已有文獻(xiàn)報(bào)道，擬南芥miRNA生物合成途徑在對抗Pst DC3000的防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

6、我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ath-miR319a、ath-miR776受Xcc誘導(dǎo)，它們的生物合成途徑是否在抗Xcc入侵的防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮作用，是我們感興趣的問題。為了研究它們的生物合成途徑是否在抗Xcc中發(fā)揮作用，我們檢測了Xcc8004及其6個(gè)致病相關(guān)突變體Xcc8004△hrpG、Xcc8004△hrpX、Xcc8004△hrcV、Xcc8004△Zur、Xcc8004△rpf、Xcc8004△csrA在野生型擬南芥（生態(tài)型為col-0型）

7、以及15個(gè)擬南芥miRNA pathway相關(guān)作用元件蛋白突變體(dcl1-4、dcl2-1、dcl3-1、ago4-1t、ago6-2、ago7-1、ago10、ago5、ago2、ago9-4、hyl1、rdr6-11、rdr2-2、hen1、hen3)中的致病性差異。我們發(fā)現(xiàn)Xcc8004、Xcc8004△hrpG、Xcc8004△hrpX、Xcc8004△hrcV、Xcc8004△Zur、Xcc8004△rpfG和Xcc8004