十字花科黑腐病菌中表達受酸堿影響的十個小RNA的鑒定和功能研究.pdf

1、細菌小 RNA（small RNAs,sRNAs),也稱為非編碼 RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)和調(diào)控RNA(Regulatory RNA),是一類大小通常在50~500 nt之間,不編碼蛋白,但是具有獨立功能的RNA分子。研究表明,細菌小RNA參與了細胞糖代謝、金屬離子轉(zhuǎn)運、群體感應(yīng)、致病、以及包括對酸堿等環(huán)境脅迫應(yīng)答等多方面的細胞生理過程。最近十幾年來,由于有效鑒定小RNA方法的建立,越來越多的細菌小RNA被

2、鑒定,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了上千個細菌小RNA,但只有少數(shù)細菌小RNA的生物學(xué)功能被確定。
　　十字花科黑腐病菌,也叫野油菜黃單胞菌致病變種(Xanthomonas campestris pv.campertris,Xcc)是引起十字花科植物(其中包括重要的蔬菜如蘿卜、白菜、甘藍及重要的油料作物油菜等)發(fā)生黑腐病的病原菌。為了尋找Xcc中參與酸堿脅迫應(yīng)答的小 RNA,本實驗室之前通過采用高通量深度測序方法,初步鑒定了500多個表達受酸堿影

3、響的候選小RNA,但這些候選小RNA是否真正存在、表達是否真的受酸堿影響、以及它們的生物學(xué)功能還需要進一步研究。在本研究中,我們從中選取了十個候選小RNA(重新命名為 sRXCC-25到sRXCC-34)作為研究對象,首先采用三引物RT-PCR法證實它們的存在,然后用半定量RT-PCR方法確定它們的表達是否受受酸堿影響,最后通過構(gòu)建它們的過量表達株和缺失突變體并進行表型分析來確定它們的生物學(xué)功能。
　　三引物RT-PCR結(jié)果證明這

4、十個小RNA是真實存在的。接著我們還用鏈特異 PCR方法確定了它們的轉(zhuǎn)錄方向。半定量 RT-PCR結(jié)果顯示,所有十個目的小RNA的表達均受到酸影響,其中五個小RNA(sRXCC-26至sRXCC-30)的表達同時還受到堿的影響。到目前為止,我們已經(jīng)獲得了所有十個目的小RNA(sRXCC-25到sRXCC-34)的過量表達株(分別命名為OE25到OE34),以及六個小RNA(sRXCC-25、sRXCC-29、sRXCC-30、sRXCC

5、-31、sRXCC-33和sRXCC-34)的缺失突變體(分別命名為DM25、DM29、DM30、DM31、DM33和DM34)。我們對所構(gòu)建的所有缺失突變體和過量表達株的以下表型:(1)對酸堿的耐受能力、(2)胞外多糖產(chǎn)量和胞外酶活性、(3)對SDS和NaCl的耐受力、(4)對重金屬的耐受能力、(5)游動能力、(6)生物膜形成、(7)生長、(8)在寄主植物上的致病力、以及(9)在非寄主植物上引起高敏反應(yīng)(HR反應(yīng))能力等表型進行了檢測

6、,并和野生型菌株和帶有空的過量表達載體 pBBad18K的野生型菌株的表型進行分析比較。結(jié)果顯示,除了在平板檢測實驗中,所有十個目的小RNA的過量表達株對 Zn2+和Ni2+的耐受力均比帶有空的過量表達載體的野生型菌株(WT/pBBad18K)的明顯下降外,其余所有完成檢測的過量表達株和缺失突變體的全部檢測表型和對照菌株一致。這些結(jié)果表明,這十個小RNA在Xcc對Zn2+和Ni2+的耐受過程中起重要作用。
　　綜上所述,本工作驗證