十字花科黑腐病菌中表達受ZnSO4和EDTA影響的小RNA的鑒定和功能研究.pdf

1、細菌小RNA是長度為50-500 nt，一般不含有開放閱讀框(ORF)，因此不編碼蛋白，但是卻有獨立的功能的RNA分子。小RNA廣泛存在于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌中;它們在細菌的碳代謝、細胞運動、群體感應、致病以及對環(huán)境脅迫的應答等許多不同的生理過程發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用。眾所周知，細菌對環(huán)境具有極強的適應性，而最近的研究發(fā)現(xiàn)，小RNA在細菌應對環(huán)境脅迫的適應中發(fā)揮了非常重要的作用。在眾多的環(huán)境脅迫中，重金屬脅迫（重金屬離子過量或缺

2、乏）是細菌在自然生存條件下經(jīng)常遇到的環(huán)境脅迫之一。已有證據(jù)證明，小RNA在調(diào)控細菌的鐵離子代謝中起關鍵作用。但是，小RNA在包括鋅離子在內(nèi)的其它重金屬代謝中的作用還不十分清楚。
　　 十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc)是引起甘藍、蘿卜、白菜、油菜等十字花科農(nóng)作物黑腐病的病原菌，同時也是研究病原細菌致病分子機理的模式菌之一。為了鑒定Xcc中參與對高鋅離子濃度的耐受以

3、及對缺鋅條件的適應的小RNA，本研究首先采用RNA測序(RNA-seq)技術，鑒定了Xcc中表達受添加ZnSO4和EDTA影響的小RNA，然后對部分表達受添加ZnSO4和EDTA影響的小RNA的生物學功能進行了鑒定。
　　 為了在全基因組水平上鑒定Xcc中表達受ZnSO4和EDTA影響的小RNA，本研究分別在豐富培養(yǎng)基NYG以及在添加了EDTA（終濃度為300μM）或ZnSO4（終濃度為350μM）的NYG培養(yǎng)基中培養(yǎng)Xcc80

4、04菌株至對數(shù)期，然后收集細胞提取總RNA。去除rRNA后，用變性PAGE膠對總RNA進行電泳分離，然后分別回收總RNA中大小為50-200 nt和201-500 nt的小分子RNA，最后進行Solexa cDNA庫構建和測序。接著，用本實驗室之前建立的方法對Solexa測序數(shù)據(jù)進行分析，找出表達受ZnSO4和EDTA影響的候選小RNA。最后，用Northem雜交或RT-PCR對這些選小RNA進行驗證。
　　 Solexa測序數(shù)

5、據(jù)分析結果顯示，以表達豐度差異大于或等于5倍為篩選條件，表達受ZnSO4影響的有222個（誘導81個，抑制145個），受EDTA影響的候選小RNA有540個（誘導334個，抑制206個），表達同時受EDTA和ZnSO4影響的有108個（同時受誘導47個，同時受抑制61個）。本研究隨機選了17個表達受EDTA或ZnSO4影響的候選小RNA進行Northern雜交或半定量RT-PCR驗證，結果與Solexa測序數(shù)據(jù)基本一致，說明本研究的So

6、lexa測序在小RNA的定性和定量方面均是可靠的。
　　 為了確定候選小RNA的轉錄方向，本研究分別通過Northern雜交或鏈特異性RT-PCR對部分小RNA的轉錄方向進行確定，目前，本研究已經(jīng)確定了11個小RNA的轉錄方向。
　　 為了弄清這些表達受EDTA和ZnSO4影響的小RNA是否在Xcc對重金屬脅迫的適應中發(fā)揮作用，本研究分別通過缺失和過量表達兩種方法對這些小RNA的功能進行研究。目前已經(jīng)完成了6個小RNA的

7、缺失突變體和過量表達株的構建，并對這些缺失突變體和過量表達株對EDTA的耐受力以及對Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Cd2+和Cu2+等重金屬離子的耐受力進行了分析。結果顯示，這6個表達受ZnSO4和EDTA影響的小RNA的缺失突變體和過量表達株對EDTA的耐受力以及對Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Cd2+和Cu2+等重金屬離子的耐受力和野生型菌株沒有顯著差異，說明這些小RNA在Xcc對重金屬脅迫的適應中沒有或只發(fā)揮微

8、弱的作用。此外，本研究還對這6小RNA的缺失突變體和過量表達株的致病力、致病因子產(chǎn)生、細胞運動性等表型進行了檢測和分析。結果顯示，它們在致病力、致病因子產(chǎn)生、細胞運動性等方面和野生型菌株沒有顯著差異。說明這些小RNA在這些表型相關的細胞過程中沒有作用或只發(fā)揮微弱的作用。
　　 綜上所述，本工作采用RNA測序方法，在Xcc8004中發(fā)現(xiàn)了幾百個表達受ZnSO4和EDTA影響的候選小RNA，其中17個通過了Northern雜交或半定