十字花科黑腐病菌中一個I型S-腺苷甲硫氨酸核開關(guān)的鑒定.pdf

1、核開關(guān)（Riboswitch）是一段具有調(diào)控功能的RNA序列;它通常位于mRNA分子的5'非翻譯區(qū)(5' untranslated regions，5' UTR)，可以不依賴任何蛋白的參與，通過與小分子物質(zhì)的直接結(jié)合來調(diào)控該mRNA的轉(zhuǎn)錄或/和翻譯。核開關(guān)是近10年才發(fā)現(xiàn)的一種全新的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。盡管在植物、真菌和古細(xì)菌中也存在核開關(guān)，但目前已鑒定的大多數(shù)核開關(guān)都存在于細(xì)菌中。迄今為止，人們已經(jīng)在大腸桿菌（Escherichia c

2、oli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等生物中鑒定了硫胺素焦磷酸核開關(guān)(Thiamine pyrophosphate Riboswitch，TPP Riboswitch)、黃素單核苷酸核開關(guān)(Flavin mononucleotide Riboswitch，F(xiàn)MN Riboswitch)、S-腺苷甲硫氨酸核開關(guān)（S-adenosyl methionine Riboswitch，SAM Riboswitch）等19種

3、核開關(guān);它們在調(diào)控維生素、氨基酸、核苷酸和輔酶合成等基礎(chǔ)代謝過程中發(fā)揮著極其重要的作用。盡管目前核開關(guān)存在的廣泛性和功能的重要性已經(jīng)逐步得到確認(rèn)，但是，在包括十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris，簡稱Xcc)在內(nèi)的植物病原細(xì)菌中，有功能的核開關(guān)尚未見報道。
　　 S-腺苷甲硫氨酸核開關(guān)（以下簡稱SAM核開關(guān)）通常位于細(xì)菌編碼甲硫氨酸(Methionine)或半胱氨酸(Cyst

4、eine)生物合成途徑的關(guān)鍵酶的mRNA的5'非翻譯區(qū)，它通過與細(xì)胞中S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)的結(jié)合來調(diào)控這些酶的表達(dá)。目前已經(jīng)在枯草芽孢桿菌、遍在遠(yuǎn)洋桿菌（Candidatus Pelagibacter ubique）、放線菌(Actinomycetes)等細(xì)菌中鑒定了5種類型SAM核開關(guān)（SAM-I至SAM-V核開關(guān)）;它們在調(diào)控細(xì)胞的甲硫氨酸生物合成中起關(guān)鍵作用。之前，本實(shí)驗(yàn)室通過RN

5、A測序發(fā)現(xiàn)，十字花科黑腐病菌8004菌株(Xcc8004)XC1251基因的起始密碼子前(72bp至192 bp)存在一段與SAM-I核開關(guān)序列同源的序列（命名為SAM-IXcc）。本研究對SAM-IXcc是否是一個真正具有調(diào)控功能的核開關(guān)進(jìn)行了鑒定。
　　 根據(jù)Xcc8004基因組測序及基因注釋結(jié)果，SAM-IXcc下游是三個緊密相鄰且轉(zhuǎn)錄方向相同的編碼細(xì)菌中甲硫氨酸合成途徑關(guān)鍵酶的基因:XC1251編碼高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶

6、(Homoserine O-acetyltransferase)，XC1252編碼合胱硫醚-γ-合酶(Cystathionine gamma-synthase)，XC1253編碼高絲氨酸脫氫酶(Homoserine dehydrogenase)。RT-PCR結(jié)果證明，XC1251、XC1252、XC1253共轉(zhuǎn)錄，因此XC1251-XC1252-XC1253是一個轉(zhuǎn)錄單位。5'-RACE結(jié)果顯示，XC1251-XC1252-XC1253

7、的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于XC1251基因的起始密碼子ATG前190 bp處，證明SAM-IXcc位于XC1251-XC1252-XC1253轉(zhuǎn)錄子的5' UTR內(nèi)，符合作為核開關(guān)的基本條件。對XC1251、XC1252和XC1253的突變體在基本培養(yǎng)基中的生長檢測結(jié)果顯示，這三個基因的突變體均為甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型，證明它們的編碼產(chǎn)物確實(shí)在Xcc甲硫氨酸生物合成途徑中起關(guān)鍵作用。這一結(jié)果預(yù)示，和其他SAM-I核開關(guān)一樣，SAM-IXcc在調(diào)控X

8、cc甲硫氨酸生物合成中發(fā)揮作用。對XC1251-XC1252-XC1253轉(zhuǎn)錄單位的gusA轉(zhuǎn)錄融合報告菌株003H02的GUS活性檢測結(jié)果顯示，XC1251-XC1252-XC1253的轉(zhuǎn)錄受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的特異性抑制。為了證明XC1251-XC1252-XC1253的轉(zhuǎn)錄受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的抑制不是通過XC1251-XC1252-XC1253啟動子的作用，本研究將XC1251-XC1252-XC1253的5'

9、UTR區(qū)連接在帶有SD序列的gusA基因的編碼序列前面，然后再連接到表達(dá)載體pLARF3的Lac啟動子后面，獲得gusA翻譯融合報告質(zhì)粒，將其導(dǎo)入Xcc8004后獲得gus報告菌株。GUS活性檢測結(jié)果顯示，報告菌株的GUS活性受甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的強(qiáng)烈抑制。由于Lac啟動子在Xcc中是組成型啟動子，因此，感受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸并抑制gusA表達(dá)的順式作用元件必定存在于XC1251-XC1252-XC1253的5' UTR

10、序列中。由于在構(gòu)建的gusA翻譯融合報告質(zhì)粒中，連接在gusA基因前面的序列除了SAM-IXcc核開關(guān)外，還有其他序列，為了證明感受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸并抑制gusA表達(dá)的順式作用元件是SAM-IXcc，本研究將報告質(zhì)粒中SAM-IXcc核開關(guān)可能的感受（結(jié)合）S-腺苷甲硫氨酸的核苷酸進(jìn)行了定點(diǎn)突變。GUS活性檢測結(jié)果顯示，攜帶SAM-IXcc核開關(guān)點(diǎn)突變報告質(zhì)粒的Xcc8004菌株在添加甲硫氨酸的基本培養(yǎng)基中檢測到的GUS活性比

11、攜帶野生型SAM-IXcc核開關(guān)報告質(zhì)粒的菌株的GUS活性顯著增強(qiáng)。說明SAM-IXcc突變導(dǎo)致其對甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的響應(yīng)遲鈍，證明報告質(zhì)粒中感受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸并抑制gusA表達(dá)的順式作用元件就是SAM-IXcc核開關(guān)。
　　 總之，以上結(jié)果證明:存在于Xcc8004基因組XC1251基因的起始密碼子前72 bp至192 bp處的一段與SAM-I核開關(guān)同源的序列，SAM-IXcc，是一個具有調(diào)控功能的(Ⅰ)

12、型SAM核開關(guān)。它通過感受細(xì)胞中S-腺苷甲硫氨酸濃度來調(diào)節(jié)甲硫氨酸合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，從而達(dá)到對細(xì)胞甲硫氨酸合成途徑的調(diào)控。據(jù)悉，這是植物病原細(xì)菌中第一個被證實(shí)的有調(diào)控功能的核開關(guān)。
　　 此外，本研究結(jié)果還預(yù)示， SAM-Xcc核開關(guān)調(diào)控XC1251-XC1252-XC1253轉(zhuǎn)錄的機(jī)制與目前已知的SAM-I核開關(guān)的調(diào)控機(jī)制有所不同。但是，SAM-IXcc核開關(guān)調(diào)控XC1251-XC1252-XC1253轉(zhuǎn)錄的確切機(jī)制還