CYLD在瘢痕疙瘩中的表達(dá)及曲古抑菌素A和三羥基異黃酮對CYLD的影響.pdf

1、第一部分 CYLD在瘢痕疙瘩及正常皮膚組織中的表達(dá)及意義
　　目的:探討腫瘤抑制基因CYLD在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、正常皮膚及正常瘢痕成纖維細(xì)胞中是否存在異常表達(dá)，以期能為瘢痕疙瘩的治療找到一個新的作用位點(diǎn)。
　　方法:收集臨床手術(shù)切除的皮膚標(biāo)本72例，分為正常皮膚組（A組）、正常瘢痕組（B組）、瘢痕疙瘩組（C組）、增生性瘢痕組（D組）。免疫組織化學(xué)技術(shù)（SP法）和Western-blot檢測各組CYLD的表達(dá)情況并對結(jié)果進(jìn)

2、行差異比較；另收集瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及周圍正常皮膚組織，采用組織塊貼壁法進(jìn)行原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)， Western-blot檢測CYLD基因在三種成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:①免疫組化結(jié)果表明CYLD蛋白在A組（0.776±0.150）與B組（0.706±0.065）中的陽性表達(dá)明顯高于C組（0.173±0.070）與D組（0.213±0.107）；C組、D組分別于A組比較（P值均為0.00， P<0.05），C組、D組分

3、別與B組比較（P值均為0.00，P<0.05）差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；② Western-blot結(jié)果顯示CYLD蛋白在正常皮膚（0.550±0.024）與正常瘢痕組織（0.442±0.075）中的表達(dá)明顯高于瘢痕疙瘩（0.068±0.013）與增生性瘢痕（0.178±0.026）；③ CYLD蛋白在正常成纖維細(xì)胞(0.564±0.037)中的表達(dá)同樣明顯高于瘢痕疙瘩(0.240±0.022)與增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(0.256±0.038

4、)。
　　結(jié)論: CYLD在瘢痕疙瘩組織及細(xì)胞中的表達(dá)均低于正常皮膚與正常瘢痕，表明CYLD基因的低表達(dá)可能與瘢痕疙瘩的形成具有一定的關(guān)系。
　　第二部分曲古抑菌素A和三羥基異黃酮對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及CYLD基因表達(dá)的影響
　　目的:研究乙?；敢种苿┣乓志谹(TrichostatinA,TSA)和三羥基異黃酮（three hydroxy isoflavone，Genistein）對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)

5、胞（Keloid fibroblasts，KFb）的增殖、凋亡及對腫瘤抑制基因CYLD表達(dá)的影響。
　　方法:采用組織塊法原代培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，用不同濃度的Genistein和TSA作用于KFb，通過MTT實(shí)驗(yàn)計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)及最佳干預(yù)時間。實(shí)驗(yàn)分為四組，TSA組（T組）：添加含IC50 TSA的培養(yǎng)液處理；Genistein組（G組）：添加含IC50 Genistein的培養(yǎng)液處理；TSA+Genist

6、ein組（T+G組）：添加含IC50的TSA與 Genistein的培養(yǎng)液處理;空白對照組：只加入等量的培養(yǎng)基。錐蟲藍(lán)拒染法觀察藥物對KFb生長的影響；流式細(xì)胞儀檢測各干預(yù)及對照組成纖維細(xì)胞的周期及凋亡；實(shí)時熒光定量PCR檢測藥物干預(yù)后各組細(xì)胞CYLD基因mRNA的表達(dá)情況；Western-blot檢測藥物干預(yù)后各組細(xì)胞CYLD蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:①根據(jù)MTT結(jié)果選擇600nmol/L的TSA和100μmol/L的Geni

7、stein做為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳干預(yù)劑量；②流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明， Genistein組、TSA組、TSA+Genistein組中G2/M期細(xì)胞所占百分比分別為（10.82±0.31）％、（11.11±0.58）%、（17.60±0.62）%，高于對照組的（7.11±0.58）%，（F=198.714，P=0.000）；G0/G1期細(xì)胞所占百分比分別為（59.25±1.23）%、（60.26±0.74）%、(48.69±1.55)%，低于對照

8、組的(74.21±2.40)%，（F=128.458，P=0.000）。Genistein組、TSA組、TSA+Genistein組細(xì)胞凋亡率分別為（31.40±4.07）%、(32.90±3.87)%、(61.09±0.55)%，與對照組（4.31±2.12）%比較，差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(F=177.439，P=0.000)。③熒光定量PCR結(jié)果顯示CYLDmRNA在TSA組（1.16±0.16）、Genistein組（1.00±0

9、.09）、TSA+Genistein組（1.45±0.09）中的表達(dá)較對照組（0.47±0.10）明顯升高（F=36.373，P=0.000）。④Western blot結(jié)果表明CYLD蛋白在TSA組（0.53±0.04）、Genistein組（0.52±0.03）、TSA+Genistein組（0.87±0.05）中的表達(dá)明顯高于對照組（0.26±0.02）,（F=132.629，P=0.000）。
　　結(jié)論:曲古抑菌素A與三羥