三羥基異黃酮對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的影響及相關(guān)信號作用機制的研究.pdf

1、增生性瘢痕(hyperplastic scar，HS)的本質(zhì)是成纖維細(xì)胞的異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，其在外觀和功能上嚴(yán)重影響患者的身體健康與生活質(zhì)量。盡管對瘢痕的發(fā)病機理和防治方法進行了大量的研究，但迄今尚無理想的結(jié)果，尋求特殊有效的治療手段一直是整形外科研究的重要課題。5，7，4'-三羥基異黃酮(Genistein)是來源于豆類的植物雌激素類化合物，它是一種特異性酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase，T

2、PK)抑制劑，大量實驗研究及流行病學(xué)調(diào)查表明Genistein對多種異常增殖的腫瘤和組織器官纖維化疾病有顯著的抑制作用，并已開始用于臨床治療，獲得了安全可靠的效果。根據(jù)Genistein的生物學(xué)特點及藥理性質(zhì)，其有可能在病理性瘢痕的防治上也發(fā)揮良好的作用。 目的： 研究Genistein對HS成纖維細(xì)胞增殖與功能的生物學(xué)影響并初步探討其作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。應(yīng)用體外培養(yǎng)人HS成纖維細(xì)胞模型，觀察Genistein對細(xì)胞的增

3、殖、凋亡及部分生物學(xué)功能的影響，以及Genistein作用后細(xì)胞內(nèi)受體酪氨酸蛋白激酶信號通路中多個相關(guān)信號蛋白分子活化的變化情況，明確Genistein對HS成纖維細(xì)胞的生物學(xué)作用并從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑初步探討其可能的作用機制，為臨床應(yīng)用異黃酮類藥物防治增生性瘢痕提供理想的實驗依據(jù)。 方法： 1．分離培養(yǎng)人HS成纖維細(xì)胞，加入不同濃度的Genistein作用，觀察藥物對細(xì)胞生長的影響；MTT法檢測細(xì)胞增殖；免疫細(xì)胞化學(xué)法測定細(xì)

4、胞PCNA表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡；Western Blot蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)。 2．不同濃度Genistein作用后，H<'3>-脯氨酸摻入法檢測HS成纖維細(xì)胞膠原合成率以及用RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA的表達(dá)變化；Western Blot法檢測TGF-β1蛋白表達(dá)；激光共聚焦顯微鏡觀察Genistein對細(xì)胞內(nèi)Ca<

5、'2+>濃度的影響變化。 3．[γ-<'32>p] ATP底物摻入法檢測Genistein作用后HS成纖維細(xì)胞TPK活性變化； Western Blot法檢測Genistein作用后受體依賴型酪氨酸蛋白激酶兩條主要信號通路Ras-MAPK以及P13K-Akt中的重要信號蛋白分子c-Raf、MEK1/2、ERK1/2、p38、JNK、Akt磷酸化蛋白的表達(dá)變化，初步探討其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用機制。 結(jié)果： 1．加入

6、Genistein共培養(yǎng)后，HS成纖維細(xì)胞生長速度減慢，生長曲線顯示細(xì)胞數(shù)量增長的趨勢隨藥物劑量增加及作用時間延長而下降；細(xì)胞逐漸失去雙極性的纖維化細(xì)胞形態(tài)特征，排列紊亂，與鄰近細(xì)胞的接觸減少。 2．MTT比色結(jié)果顯示Genistein作用后各實驗組HS成纖維細(xì)胞的OD值減少，具有劑量—效應(yīng)和時間—效應(yīng)關(guān)系，其中100μmol/L組的抑制作用最為顯著。 3．各實驗組HS成纖維細(xì)胞內(nèi)PCNA的含量下降。 4．Gen

7、istein作用后G<,0>-G<,1>期細(xì)胞數(shù)量減少，G<,2>-M期細(xì)胞比例上升；100μmol/L組中的S期細(xì)胞數(shù)量也有增加。 5．Genistein作用后細(xì)胞凋亡率增加；Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)上調(diào)。 6．在Genistein作用下，HS成纖維細(xì)胞的膠原合成率降低；Ⅰ型及Ⅲ型前膠原蛋白mRNA表達(dá)下調(diào)。 7．各實驗組細(xì)胞TGF-β1蛋白的表達(dá)減少。 8．加入Ge

8、nistein后細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度下降；加入bFGF后細(xì)胞Ca<'2+>濃度升高，預(yù)先用Genistein處理可使bFGF促Ca<'2+>增高的作用顯著減弱。 9．加入Genistein后細(xì)胞內(nèi)TPK活性顯著下降，并可減弱bFGF促進細(xì)胞TPK活性增加的作用。 10．不同濃度Genistein作用HS成纖維細(xì)胞后，胞內(nèi)磷酸化c-Raf、MEK1/2、ERK1/2、p38、Akt蛋白的含量均有不同程度的降低，其中c-

9、Raf、ERK1/2、Akt的下降變化較明顯；磷酸化JNK蛋白含量與對照組相比無顯著性差異。在Genistein作用下，加入bFGF刺激后細(xì)胞內(nèi)各信號蛋白的表達(dá)顯示同樣的變化趨勢。 結(jié)論： 1．Genistein能有效抑制HS成纖維細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用與影響細(xì)胞周期和調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。 2．Genistein能影響HS成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能，包括抑制細(xì)胞膠原的合成、減少T