曲古抑菌素A對(duì)梅花鹿卵巢顆粒細(xì)胞增殖和組蛋白乙酰化的影響.pdf

1、在動(dòng)物生殖過(guò)程中，卵巢顆粒細(xì)胞扮演著極其重要的作用，不僅可以調(diào)控卵泡的發(fā)育，還能為卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和信號(hào)傳導(dǎo)。顆粒細(xì)胞增殖過(guò)程中會(huì)發(fā)生多種表觀遺傳修飾，其中，組蛋白乙?；揎椗c顆粒細(xì)胞類固醇激素分泌、細(xì)胞凋亡和周期密切相關(guān)。作為組蛋白去乙?；敢种苿?，曲古抑菌素A(TSA)可以促進(jìn)細(xì)胞的乙?；岣呋蛐蛄械恼Ｐ?，在豬牛等動(dòng)物顆粒細(xì)胞上多有研究，在特種動(dòng)物上鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以梅花鹿卵巢顆粒細(xì)胞為研究對(duì)象，進(jìn)行顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)、增殖活

2、性檢測(cè)、凋亡周期檢測(cè)以及組蛋白乙?；芯康纫幌盗性囼?yàn)，探討TSA對(duì)梅花鹿顆粒細(xì)胞活性、類固醇激素分泌、細(xì)胞凋亡以及組蛋白乙?；挠绊?，以期探明梅花鹿顆粒細(xì)胞增殖過(guò)程中組蛋白乙?；男揎棛C(jī)制。本試驗(yàn)一共包括以下幾個(gè)內(nèi)容:
　　1、顆粒細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)和鑒定:利用活體采卵技術(shù)收集卵泡液，低速離心，從卵泡液中分離梅花鹿顆粒細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM/F12添加10％胎牛血清和1％青鏈霉素培養(yǎng)顆粒細(xì)胞，通過(guò)FSHR抗體熒光手段結(jié)合HE

3、染色鑒定顆粒細(xì)胞。結(jié)果表明，梅花鹿卵巢顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)良好，HE染色細(xì)胞形態(tài)完整，F(xiàn)SHR陽(yáng)性率＞90‰由此得出梅花鹿顆粒細(xì)胞純度高于90％，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、TSA對(duì)梅花鹿顆粒細(xì)胞增殖活性及雌二醇和孕酮分泌的影響:用含有不同濃度TSA(0nM、10nM、50nM、100nM、500nM)的DMEM/F12培養(yǎng)液處理顆粒細(xì)胞48h，用CCK法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中雌二醇和孕酮水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSA

4、對(duì)梅花鹿顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制性，并且這種抑制性呈劑量依賴效應(yīng)。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TSA濃度為10nM和50nM時(shí)雌二醇水平明顯上升(p＜0.05)，并且在50nM時(shí)最高(p＜0.05)。而當(dāng)TSA濃度為100nM時(shí)，雌二醇水平開始下降，但仍高于對(duì)照組(p＜0.05)且低于10nM時(shí)的水平(p＜0.05)，500nM時(shí)的分泌水平與對(duì)照組差異不顯著(p＞0.05)。孕酮檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TSA濃度為10nM、50nM、100nM時(shí)，三者之間

5、孕酮水平差異不顯著(p＞0.05)，但均高于對(duì)照組(p＜0.05)，而當(dāng)TSA為500nM時(shí)，孕酮的分泌量低于對(duì)照組(p＜0.05)。說(shuō)明TSA濃度低于100nM時(shí)可以促進(jìn)雌二醇和孕酮的分泌，濃度為500nM時(shí)不利于二者的分泌。
　　3、TSA對(duì)梅花鹿顆粒細(xì)胞凋亡的作用和周期分布的影響:采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法和PI單染法結(jié)合流式細(xì)胞儀，分別檢測(cè)不同濃度TSA處理后的顆粒細(xì)胞的凋亡和周期分布;用qRT-PCR技術(shù)

6、檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白(BCL-XL、BAX、GLUT3、GLUT8)和周期相關(guān)蛋白(Cyclin D2、CDK4)的基因表達(dá)量。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSA具有促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)細(xì)胞G2期沒(méi)有明顯影響，但當(dāng)濃度高于10nM時(shí)，它會(huì)呈現(xiàn)出對(duì)G1期的促進(jìn)作用，及對(duì)S期的抑制作用。QRT-PCR結(jié)果表明，隨TSA濃度升高，GLUT3、GLUT8、BCL-XL、Cyclin D2和CDK4的mRNA表達(dá)均呈現(xiàn)出遞減趨勢(shì)(p＜0.05)，而BAX的m

7、RNA表達(dá)呈遞增趨勢(shì)(p＜0.05)。
　　4、TSA對(duì)梅花鹿顆粒細(xì)胞組蛋白乙?；挠绊?采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同濃度TSA處理后顆粒細(xì)胞表觀遺傳修飾酶DNMT3a、DNMT1、HAT1、HDAC1的基因表達(dá)水平，采用免疫熒光技術(shù)和western blotting技術(shù)分別檢測(cè)顆粒細(xì)胞H3K9和H4K8的乙酰化水平。結(jié)果表明，隨著TSA濃度的增加，DNMT3a、DNMT1和HAT1的表達(dá)先遞增后遞減，且在TSA為50nM時(shí)表達(dá)

8、最強(qiáng)(p＜0.05)，而HDAC1的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)。免疫熒光技術(shù)和western blotting技術(shù)檢測(cè)都發(fā)現(xiàn)，隨TSA濃度的增加，H3K9和H4K8乙酰化水平均增強(qiáng)，并且H4K8乙?；潭雀哂贖3K9乙?；?。
　　綜上所述，本試驗(yàn)證明TSA對(duì)梅花鹿顆粒細(xì)胞的體外增殖有抑制作用，適當(dāng)濃度TSA(50nM)可以促進(jìn)梅花鹿顆粒細(xì)胞類固醇激素的分泌，高濃度(500nM)不利于其分泌;TSA可以誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡，使細(xì)胞周期阻抑在G0/