阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征患者端粒長度的變化及意義的研究.pdf

1、研究背景:
　　 端粒(Telomere)是位于真核生物線性染色體末端的特殊序列,由端粒DNA和端粒結(jié)合蛋白組成,起保護(hù)和穩(wěn)定染色體的作用。
　　 早在20世紀(jì)30年代,諾貝爾獎得主Hermnn Muller和Barbara Mcclintock就已經(jīng)觀測到染色體的末端結(jié)構(gòu)在避免染色體之間的融合中起了重要的作用,從而猜測它可能有保護(hù)染色體的作用。1978年,Blackburn發(fā)現(xiàn)了富含小染色體的模式生物四膜蟲的端粒含有許

2、多重復(fù)的5’-CCCCAA-3’六堿基序列,與此同時,Szostak發(fā)現(xiàn)微型染色體在導(dǎo)入酵母后會很快被降解這一現(xiàn)象,于是這兩位科學(xué)家將四膜蟲的CCCCAA序列偶聯(lián)到微型染色體上并導(dǎo)入酵母,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這段端粒序列的加入使得微型染色體免受降解,從而證實(shí)了端粒對染色體的保護(hù)作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),端?？赏ㄟ^形成t-loop緊湊結(jié)構(gòu),或者與Shelterin等端粒保護(hù)蛋白結(jié)合,從而防止染色體降解、避免末端融合,進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞生長.隨著體細(xì)胞的不斷

3、增殖,端粒會逐漸縮短,當(dāng)端?？s短至一定程度,細(xì)胞停止分裂,進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài),故有人稱端粒為正常細(xì)胞的“分裂鐘”(mistosis clock).
　　 Benetos等對193例平均年齡為56歲的人群進(jìn)行端粒平均長度的測量,發(fā)現(xiàn)端粒長度與人年齡成負(fù)相關(guān)的關(guān)系；Lee對猴子外周血單核細(xì)胞測量端粒長度發(fā)現(xiàn),端粒每年相應(yīng)縮短62.7 bp。端粒長度可以作為研究細(xì)胞衰老與生物體年齡的一種很好的方式。
　　 近幾年對中老年人群中發(fā)生睡

4、眠呼吸暫停綜合征(sleep apnea sylndrome,SAS),尤其是阻塞型睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome,OSAS)的研究越來越多,國外對該病的研究已有30余年,國內(nèi)也有近20年。SAS是一嚴(yán)重的睡眠呼吸障礙性疾病,是由于某些因?yàn)槎律虾粑雷枞?睡眠時有呼吸暫停,伴有缺氧、鼾聲、白天嗜睡等癥狀的一種較復(fù)雜的疾病。好發(fā)于肥胖者及中老年人,40-50歲年齡段患病率較高,國外報

5、道成年男性發(fā)病率為4％,女性發(fā)病率為2％,我國人群發(fā)病率為3.4％。目前35歲左右的患者發(fā)病也有上升趨勢。小兒的發(fā)病率約為1％～2％,男女發(fā)病率無差異,可見于各年齡階段,但以學(xué)齡前期最為多見。
　　 SAS主要臨床表現(xiàn)為睡眠時打鼾,且鼾聲不規(guī)則,伴有呼吸暫停和呼吸表淺,有時憋醒,夜間反復(fù)的呼吸暫停和低通氣導(dǎo)致動脈血氧飽和度下降和組織缺氧,患者會表現(xiàn)為夜尿增多,晨起頭痛,白天乏力,嗜睡,嚴(yán)重者還可出現(xiàn)記憶力、智力下降,性格改變和性

6、欲減低,許多研究報道OSAS會引致腦血管疾病、精神異常、肺心病和呼吸衰竭,糖尿病,性欲減退等一系列的并發(fā)癥,最直接的就是會誘發(fā)高血壓,導(dǎo)致冠心?。辉谀X卒中人群中高達(dá)60％。有1/5的心臟病是由睡眠呼吸暫停綜合征引起,其并發(fā)癥造成多臟器功能損害嚴(yán)重者甚至意識喪失,猝死,嚴(yán)重的影響患者的生活質(zhì)量和壽命。
　　 但目前人們對OSAS的嚴(yán)重后果不了解,對OSAS早期預(yù)防、早期診斷與早期治療認(rèn)識不足,不主動前來就醫(yī),很多病例多是出現(xiàn)嚴(yán)重的

7、心、腦、肺、腎等并發(fā)癥時才就診,以致錯過治療時機(jī),睡眠醫(yī)學(xué)是近年來新興的一門邊緣學(xué)科,SAS越來越受到醫(yī)學(xué)界和社會各界的重視,尤其是OSAS對機(jī)體影響的研究也越來越廣泛越深入,對患者做到健康教育及早期診斷與早期治療是一項(xiàng)非常重要的工作。
　　 有越來越多的研究報道說明端粒長度與冠心病、心血管疾病、腫瘤、胃癌、腸癌、肝癌、糖尿病、尿毒癥等疾病有關(guān),所以關(guān)于端粒長度變化規(guī)律的各種機(jī)制的提出,無疑是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大突破,隨著我們不斷

8、的發(fā)現(xiàn)和掌握端粒長度及其變化規(guī)律,可以看出通過端粒長度估計(jì)個體的即時年齡和預(yù)期壽命,闡述衰老機(jī)理；運(yùn)用細(xì)胞端粒長度蘊(yùn)涵的臨床病理參數(shù)和信息來調(diào)查缺氧的生物學(xué)行為和發(fā)生模式,把端粒長度作為缺氧的一種診斷依據(jù)和臨床治療指征；解決OSAS組織工程中細(xì)胞的老化問題,為阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)的治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 研究目的：
　　 探討阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)患者外周血白細(xì)胞端粒長度的變化及意義。

9、r>　　 研究對象：
　　 根據(jù)2007年美國睡眠醫(yī)學(xué)會(American Academy of Sleep Medicine,AASM)的多道睡眠圖分析標(biāo)準(zhǔn),選擇OSAS患者11例,健康對照組10例,提取外周血白細(xì)胞DNA,純度檢測合格后,用Q-PCR法檢測端粒長度相對T/S比率。
　　 研究方法：
　　 1實(shí)驗(yàn)用品：
　　 材料：兩組受試者的外周靜脈全血5ml,EDTA抗凝,置于-80℃冰箱中保存待

10、測；定量PCR專用8聯(lián)管及及管蓋。
　　 2實(shí)驗(yàn)方法:
　　 基因組 DNA的抽提：
　　 采用Takara Blood Genome DNA Extraction試劑盒抽提全血基因組DNA,測定濃度后,篩選合格標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),稀釋DNA濃度到約20ng/μL濃度。
　　 DNA濃度及純度的測定：
　　 采用Eppendof Biophotometer測定提取的DNA濃度及A260/280比值,選擇

11、合格標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 進(jìn)行PCR反應(yīng)的設(shè)置：T/S比率的計(jì)算
　　 采用熒光定量PCR儀配套軟件,分別確定T反應(yīng)及S反應(yīng)的Ct值---Ct(telomeres)及Ct(36B4),根據(jù)PCR反應(yīng)產(chǎn)物以2的指數(shù)倍遞增原理,T/S比率應(yīng)該接近于公式。
　　 3統(tǒng)計(jì)方法：
　　 所得數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行分析。組間差異的顯著性分析用兩個獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)間的相關(guān)性用Pearson相關(guān)分析法。

12、
　　 結(jié)果：
　　 1.端粒長度相對T/S比率的比較：
　　 本研究中,OSAS組端粒相對長度T/S比率為3494.71±2531.04,健康對照組端粒長度相對T/S比率為67536.01±87431.93,OSAS組端粒相對長度T/S比率較健康對照組小,二者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 2.端粒長度相對T/S比率與年齡、BMI、AHI、病程、病情分級的相關(guān)關(guān)系
　　 OSAS組端

13、粒長度相對T/S比率與年齡、BMI、AHI、病程、病情分級等均無顯著的相關(guān)性(P>0.05)。健康對照組端粒長度相對T/S比率與年齡呈負(fù)相關(guān),r=-0.713,P=0.021,但與BMI也無顯著相關(guān)性(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 OSAS患者外周血白細(xì)胞端粒長度的縮短可能與其發(fā)病機(jī)制有關(guān),低氧血癥和高碳酸血癥加速了端粒的損耗和細(xì)胞的凋亡。
　　 OSAS所引起的慢性缺氧和(或)高碳酸血癥可能加速了端粒的

14、損耗和細(xì)胞的凋亡,影響人類的健康與壽命,我們應(yīng)當(dāng)積極預(yù)防和治療OSAS。呼吸暫?？蓪?dǎo)致低氧血癥(PO2↓),高碳酸血癥(PCO2↑),甚至pH失代償,血氧飽和度可降到60％～80％。嚴(yán)重低氧可引起兒茶酚胺、腎素血管緊張素和內(nèi)皮素分泌增加,微血管收縮,內(nèi)分泌、神經(jīng)調(diào)節(jié)功能失調(diào),血流動力學(xué)和流變學(xué)改變,微循環(huán)異常使組織器官缺血、缺氧加重而導(dǎo)致多系統(tǒng)器官損害。目前的研究已知OSAS對心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、腦血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌和性功能、