內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放和CaMKⅡ-MAPK信號(hào)通路在臭氧脊髓神經(jīng)元神經(jīng)毒性的作用機(jī)制及XBP1預(yù)防靶點(diǎn)的研究.pdf

1、本研究從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放角度及后續(xù)可能的級(jí)聯(lián)反應(yīng)探討臭氧引起脊髓神經(jīng)元神經(jīng)毒性的可能機(jī)制和預(yù)防該臭氧毒性可行性措施，為將來(lái)臨床上更安全有效的使用醫(yī)用臭氧提供理論依據(jù)。
　　第一部分 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放和CaMKⅡ/MAPK信號(hào)通路在臭氧脊髓神經(jīng)元神經(jīng)毒性中的作用及其機(jī)制研究
　　目的:
　　本研究檢測(cè)體外條件下臭氧對(duì)脊髓神經(jīng)元是否具有神經(jīng)毒性，以及神經(jīng)毒性的原因是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放和CaMKⅡ/MAPK信號(hào)通路有關(guān)，進(jìn)一步

2、從細(xì)胞凋亡角度來(lái)探討臭氧引起脊髓神經(jīng)元神經(jīng)毒性的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.大鼠脊髓神經(jīng)元的原代培養(yǎng)
　　2.光學(xué)顯微鏡觀(guān)察大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)，并進(jìn)行MAP-2免疫熒光鑒定
　　3.CCK8法檢測(cè)不同濃度醫(yī)用臭氧對(duì)脊髓神經(jīng)元的毒性
　　4.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)臭氧對(duì)脊髓神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放的影響
　　用Fluo-3/AM預(yù)處理脊髓神經(jīng)元，負(fù)載后在激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)加入40μg/ml臭氧

3、培養(yǎng)液后鈣流峰值變化。
　　5.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3/RYR信號(hào)通路是否參與臭氧誘導(dǎo)的鈣離子釋放
　　6.Western blotting法檢測(cè)臭氧是否通過(guò)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放進(jìn)一步激活CaMKⅡ和MAPK信號(hào)通路
　　Western blotting法檢測(cè)臭氧處理之后phospho-CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)的表達(dá);
　　Western blotting法檢測(cè)臭氧處理是否引起CaMKⅡ的磷酸化，以

4、及是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放有關(guān);
　　Western blotting法檢測(cè)臭氧處理是否引起MAPK信號(hào)通路的表達(dá)情況的改變，以及是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放有關(guān)。
　　7.TUNEL法檢測(cè)臭氧是否通過(guò)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放、激活CaMKⅡ和MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元凋亡
　　結(jié)果:
　　1.原代培養(yǎng)新生大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)情況
　　倒置相差顯微鏡下脊髓神經(jīng)元細(xì)胞核大，界限清晰，折光性強(qiáng)，光暈明顯，有明顯的立

5、體感，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
　　2.體外培養(yǎng)大鼠脊髓神經(jīng)元鑒定
　　大鼠脊髓神經(jīng)元經(jīng)MAP-2染色后，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)分析所培養(yǎng)的神經(jīng)元純度為89.70±4.70％。
　　3.醫(yī)用臭氧劑量依賴(lài)性的導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元神經(jīng)毒性
　　通過(guò)CCK-8比色法測(cè)定不同濃度醫(yī)用臭氧干預(yù)后脊髓神經(jīng)元的存活率。0μg/ml和30μg/ml O3不影響脊髓細(xì)胞元的存活率，而40μg/ml至100μg/ml臭氧對(duì)脊髓神經(jīng)元的神經(jīng)毒性呈劑量依賴(lài)性

6、，更高濃度的臭氧干預(yù)后脊髓神經(jīng)元存活困難。
　　4.臭氧促進(jìn)脊髓神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放
　　與對(duì)照組相比，臭氧處理組加入臭氧培養(yǎng)液后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+顯著升高(P＜0.05); EGTA（細(xì)胞外鈣離子螯合劑）預(yù)處理聯(lián)合臭氧處理組細(xì)胞內(nèi)Ca2+也顯著升高(P＜0.05)，均差異極顯著(P＜0.05）。BAPTA-AM（細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑）預(yù)處理聯(lián)合臭氧處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)Ca2+無(wú)明顯升高。Trapsi處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)C

7、a2+瞬間顯著升高，之后鈣離子濃度趨于穩(wěn)定，再用臭氧處理，細(xì)胞內(nèi)Ca2+無(wú)顯著變化。
　　5.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3/RYR信號(hào)通路參與臭氧誘導(dǎo)的鈣離子釋放
　　2APB或者Dantrolin單獨(dú)處理脊髓神經(jīng)元，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無(wú)變化;2APB或者Dantrolin預(yù)處理細(xì)胞后，加入臭氧培養(yǎng)液，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度也無(wú)變化;臭氧單獨(dú)處理脊髓神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+顯著升高，與2APB或者Dantrolin單獨(dú)處理相比，差異極顯著（P＜0.05

8、），與2APB或者Dantrolin聯(lián)合臭氧處理相比，差異極顯著（P＜0.05）。
　　6.臭氧通過(guò)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放進(jìn)一步激活CaMKⅡ/MAPK信號(hào)通路
　　臭氧作用于脊髓神經(jīng)元60min后，明顯增加了p38和JNK信號(hào)通路的表達(dá)水平，而ERK1/2的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。進(jìn)一步結(jié)果顯示，臭氧激活p38和JNK信號(hào)通路的表達(dá)的作用能夠被BAPTA/AM，KN62，2APB或者Dantrolene阻斷。CaMKⅡ的磷酸化與

9、p38和JNK信號(hào)通路的表達(dá)趨勢(shì)一致。
　　7.臭氧通過(guò)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放、激活CaMKⅡ信號(hào)通路誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元凋亡
　　臭氧作用于脊髓神經(jīng)元后24小時(shí)，凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯增加。而且，臭氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用能夠被BAPTA/AM或者KN62預(yù)處理阻斷。BAPTA/AM或者KN62單獨(dú)處理不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　1.醫(yī)用臭氧對(duì)脊髓神經(jīng)元有神經(jīng)毒性作用，且呈劑量依賴(lài)性。
　　2.醫(yī)用臭氧具有神經(jīng)毒

10、性，這一過(guò)程通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放和CaMKⅡ/MAPK信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　第二部分 X-盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein1，XBP1)在臭氧神經(jīng)毒性保護(hù)機(jī)制中的作用研究
　　目的:
　　1.檢測(cè)臭氧處理脊髓神經(jīng)元后能否誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;
　　2.檢測(cè)XBP1在臭氧神經(jīng)毒性過(guò)程中是否有保護(hù)作用及保護(hù)的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.重組腺病毒Adv-XBP1的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

11、>　　2.重組腺病毒Adv-XBP1對(duì)脊髓神經(jīng)元XBP1過(guò)表達(dá)情況的鑒定
　　RT-PCR和Westem blotting法檢測(cè)重組腺病毒Adv-XBP1處理脊髓神經(jīng)元后內(nèi)XBP1 mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的變化。
　　3.觀(guān)察臭氧處理之后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況和XBP1的表達(dá)
　　Western blotting法檢測(cè)臭氧作用后脊髓神經(jīng)元內(nèi)GRP、CHOP和XBP1蛋白水平表達(dá)的變化，確定臭氧對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和XBP1通路的激

12、活作用。
　　4.觀(guān)察XBP1重組腺病毒是否通過(guò)減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護(hù)臭氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
　　Western blotting法檢測(cè)XBP1重組腺病毒預(yù)處理之后臭氧對(duì)脊髓神經(jīng)元內(nèi)GRP、CHOP和XBP1蛋白水平表達(dá)的影響，確定XBP1重組腺病毒對(duì)臭氧毒性的保護(hù)作用。
　　結(jié)果:
　　1.過(guò)表達(dá)腺病毒載體對(duì)脊髓神經(jīng)元轉(zhuǎn)染效率的鑒定
　　脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)至7-8天，用不同滴度和不同持續(xù)時(shí)間的過(guò)表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染，觀(guān)察轉(zhuǎn)

13、染后熒光強(qiáng)度的變化發(fā)現(xiàn)，最佳的轉(zhuǎn)染時(shí)間為24h，最佳的轉(zhuǎn)染滴度為80，該條件下轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80％。
　　2.過(guò)表達(dá)腺病毒載體對(duì)脊髓神經(jīng)元XBP1過(guò)表達(dá)效率的鑒定
　　Adv-XBP1過(guò)表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染脊髓神經(jīng)元之后，XBP1mRNA和相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯增加，而Adv-LacZ轉(zhuǎn)染之后XBP1表達(dá)和對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.臭氧暴露能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和XBP1的剪切
　　脊髓神經(jīng)元臭氧處理之后，GRP78和C

14、HOP蛋白的表達(dá)明顯增加。此外，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，醫(yī)用臭氧處理脊髓神經(jīng)元之后能夠增加X(jué)BP1mRNA的剪切，這種剪切與公認(rèn)的內(nèi)置網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)Tunicamycin誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，Western Blot結(jié)果顯示臭氧能夠明顯增加X(jué)BP1蛋白的表達(dá)。
　　4.過(guò)表達(dá)腺病毒對(duì)臭氧誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脊髓神經(jīng)元凋亡有保護(hù)作用
　　臭氧處理之后GRP78和CHOP蛋白的表達(dá)明顯增加，但用Adv-XBP1過(guò)

15、表達(dá)腺病毒預(yù)處理之后再用臭氧處理，GRP78和CHOP蛋白的表達(dá)較單純臭氧處理組明顯降低。Adv-XBP1過(guò)表達(dá)腺病毒預(yù)處理聯(lián)合臭氧處理脊髓神經(jīng)元與Adv-LacZ腺病毒預(yù)處理聯(lián)合臭氧處理相比，脊髓神經(jīng)元的細(xì)胞活性增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.醫(yī)用臭氧作用于脊髓神經(jīng)元能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增加X(jué)BP1的表達(dá)。
　　2.XBP1重組腺病毒能夠通過(guò)增加X(jué)BP1的表達(dá)，反饋抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減緩細(xì)胞凋