IRE1α-XBP1及ERp29在PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路凋亡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)是指經(jīng)受了突發(fā)性的巨大災(zāi)難或異乎尋常威脅后產(chǎn)生的長期持續(xù)性的精神障礙或焦慮綜合癥。PTSD發(fā)病機(jī)制的研究已涉及內(nèi)分泌學(xué)、行為學(xué)、心理學(xué)及神經(jīng)生物學(xué)等多種學(xué)科領(lǐng)域，但目前尚未明確。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞通過啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)特異性的信號(hào)系統(tǒng)來抑制蛋白翻譯，并促進(jìn)未折

2、疊蛋白加工成熟和促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白降解，從而減輕ER蛋白負(fù)荷并促進(jìn)細(xì)胞重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。然而，如果ERS嚴(yán)重且持續(xù)時(shí)間長，UPR不足以重建ER穩(wěn)態(tài)，則可能通過啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路凋亡機(jī)制引起細(xì)胞凋亡[5]。在哺乳動(dòng)物中，至少存在三種能夠感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白聚集的ER跨膜蛋白—激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor6，ATF6)，蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase，PERK)和需肌醇蛋

3、白1(inositol requiringenzyme1，IRE1)。這三個(gè)UPR信號(hào)分子可通過其胞漿結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而在起始階段抑制蛋白質(zhì)的合成，并誘導(dǎo)ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。
　　IRE1是Ⅰ型跨膜糖蛋白，其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)有兩種存在形式—IRE1α和IRE1β。IRE1α廣泛表達(dá)于不同組織中，而IRE1β只在腸道上皮細(xì)胞中有表達(dá)。IRE1α感知未折疊蛋白的蓄積后隨即與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78/BIP

4、(glucose-regulated protein78/binding immunoglobulin protein)解離而激活[9-11]?；罨腎RE1α能特異性的剪接X-盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein1 unspliced,XBP1 u) mRNA分子內(nèi)26bp的內(nèi)含子，剪接后的mRNA編碼產(chǎn)生有活性XBP-1s(XBP1 spliced)[12-14]。XBP-1 s不僅能促進(jìn)含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件(e

5、ndoplasmicreticulum stress responsive element，ERSE)的UPR靶分子如GRP78/BIP、GRP94表達(dá)以增加蛋白質(zhì)的折疊能力，而且可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解增強(qiáng)因子α甘露糖苷酶樣蛋白(ER degradation-enhancingα-mannosidase-like protein，EDEM)的表達(dá)以增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解[15]，從而恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。但I(xiàn)RE1-XBP1通路的作用

6、并不只是可以啟動(dòng)ERS的生存途徑，當(dāng)嚴(yán)重或長時(shí)程的ERS使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損時(shí)，IRE1-XBP1通路還能夠通過激活下游的凋亡信號(hào)分子，如JNK(c-JunN-terminal kinase)、CHOP/GADD153(C/EBP homologous protein/growth arrest andDNA damage-inducible gene153)、caspase-12等來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29(endopla

7、smic reticulum protein29，ERp29)是在人類肝臟蛋白二維電泳時(shí)發(fā)現(xiàn)的由261個(gè)氨基酸構(gòu)成的可溶性蛋白。ERp29作為管家蛋白廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物組織中。目前認(rèn)為ERp29作為分子伴侶參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊和分泌蛋白的輸出，但其與傳統(tǒng)的分子伴侶存在許多差異，其生物學(xué)功能目前尚未完全明確。ERp29可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白—GRP78/BIP及GRP94形成復(fù)合物相互作用[16,17]。已有研究表明XBP-1可調(diào)控內(nèi)

8、源性ERp29[18,19]，且ERp29可通過下調(diào)真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translational initiation factor2α，eIF2a)而使Hsp27表達(dá)上調(diào)以抑制doxorubicin誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]。同時(shí)ERp29可使p58IPK的表達(dá)上調(diào)，從而減少eIF2a的磷酸化，并抑制ATF4/CHOP/caspase-3促凋亡通路來促進(jìn)細(xì)胞存活[21]。
　　目前研究顯示，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病

9、的發(fā)病機(jī)制都與過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡有關(guān)[22-27]，而PTSD正是應(yīng)激性精神障礙，其致病因素均屬于超強(qiáng)刺激，可能會(huì)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過度。由此我們推斷:PTSD發(fā)病很可能也與過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。本課題組已有研究表明，PTSD大鼠內(nèi)側(cè)前額皮質(zhì)(medial prefrontal cortex，mPFC)神經(jīng)元出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的改變，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)改變、體積縮小，引起功能下降，與PTSD的發(fā)病機(jī)制有一定關(guān)系[28,29]。鑒于IRE1-XBP1

10、通路及分子伴侶ERp29在UPR及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路細(xì)胞凋亡上的重要作用，我們將其作為了研究切入點(diǎn)，以深入探討PTSD的病理生理機(jī)制。
　　方法:
　　1、采用單一連續(xù)應(yīng)激(Single-Prolonged Stress，SPS)方法刺激大鼠構(gòu)建PTSD大鼠模型，120只雄性Wistar大鼠被隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組、SPS1d組、SPS4d組、SPS7d組及SPS14d組;
　　2、觀察正常對(duì)照組和模型組大鼠的一般狀態(tài)，并隔

11、日測定大鼠體重，觀察體重增長變化;
　　3、采用Morries水迷宮測試SPS刺激后大鼠的空間記憶和學(xué)習(xí)能力的表現(xiàn)，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。
　　4、采用原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元凋亡變化;
　　5、采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)檢測caspase-12 mRNA變化;
　　6、采用免疫熒光雙標(biāo)、Western blotting及qRT-PCR檢測正常

12、對(duì)照組和模型組大鼠mPFC IRE1α和XBP1蛋白表達(dá)及mRNA分子水平表達(dá);
　　7、采用免疫組織化學(xué)技術(shù)、Western blotting及qRT-PCR檢測正常對(duì)照組和模型組大鼠mPFC ERp29蛋白表達(dá)及mRNA分子水平表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　一、PTSD大鼠一般情況及體重增長變化
　　SPS刺激后，大鼠表現(xiàn)出PTSD樣癥狀，如食欲不振、煩躁易怒等。同時(shí)，PTSD大鼠的體重增長明顯較正常對(duì)照組緩慢。<

13、br>　　二、PTSD大鼠行為學(xué)改變
　　Morries水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠平均逃避潛伏期顯著高于正常對(duì)照組，同時(shí)空間探索實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間百分比明顯低于正常對(duì)照組。
　　三、PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元凋亡變化
　　TUNEL染色結(jié)果顯示PTSD大鼠mPFC中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間延長而逐漸增多，于SPS刺激后第7d達(dá)到高峰，之后逐漸下降。
　　四、PTSD大鼠mPFC中

14、caspase-12 mRNA變化
　　qRT-PCR結(jié)果顯示SPS刺激后，caspase-12 mRNA水平明顯上調(diào)，于第7d達(dá)到高峰，之后逐漸下降。
　　五、PTSD大鼠mPFC中IRE1α和XBP1的表達(dá)變化
　　1、免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果
　　激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠IRE1α和XBP1主要共表達(dá)于mPFC神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中，SPS刺激后4d XBP1在細(xì)胞核中明顯表達(dá)。在SPS刺激后早期即出現(xiàn)

15、IRE1α和XBP1的表達(dá)增加，然后逐漸降低。
　　2、Western blotting檢測結(jié)果
　　IRE1α蛋白表達(dá)于SPS刺激1d后明顯增加，隨后逐漸下降，并于第14d完全消失。SPS刺激1d后，XBP1u蛋白表達(dá)水平顯著增加，隨后逐漸下降，而其活性形式XBP1 s于SPS刺激1d后明顯出現(xiàn)，并于第4d達(dá)到高峰。
　　3、qRT-PCR檢測結(jié)果
　　與Western blotting檢測結(jié)果相一致，SPS1

16、d組和SPS4d組IRE1α mRNA水平較正常對(duì)照組顯著升高。XBP1 mRNA水平在SPS刺激1d后明顯升高，隨后逐漸下降。
　　六、PTSD大鼠mPFC中ERp29的表達(dá)變化
　　1、免疫組織化學(xué)結(jié)果
　　SPS刺激后1d后，大鼠mPFC神經(jīng)元內(nèi)ERp29表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加，于第4d達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。
　　2、Western blotting檢測結(jié)果
　　ERp29蛋白表達(dá)于SPS刺激1d

17、后明顯增加，于第4d達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。
　　3、qRT-PCR檢測結(jié)果
　　與Westem blotting檢測結(jié)果相一致，ERp29 mRNA水平于SPS刺激1d后開始升高，于第4d達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。
　　結(jié)論:
　　1、PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元出現(xiàn)細(xì)胞凋亡變化，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路凋亡關(guān)鍵分子的caspase-12參與了PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元凋亡的調(diào)控。
　　2、IRE1α-XBP1通路介導(dǎo)