基于IRE1α-JNK通路研究解毒通絡(luò)調(diào)肝方對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響.pdf

1、目的:觀察解毒通絡(luò)調(diào)肝方對改善T2DM模型大鼠IR的作用及對衣霉素刺激HepG2細(xì)胞炎癥因子及蛋白表達(dá)的影響。
　　方法:1、以長期高脂顆粒料Purina＃5008喂養(yǎng)ZDF大鼠的方法復(fù)制實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠動物模型。應(yīng)用中藥解毒通絡(luò)調(diào)肝方（高、中、低濃度）對其進(jìn)行干預(yù)，以西藥二甲雙胍作為陽性藥物對照，觀察藥物對T2DM模型大鼠體質(zhì)量、尿量、飲水量、糖脂代謝、胰島素敏感指數(shù)及肝組織中IRE1、P-IRE1、JNK，P-JNK、IR

2、S-1及PI3K的表達(dá)。2、體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞檢測解毒通絡(luò)調(diào)肝方不同濃度(12.5ug/mL、25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL)對細(xì)胞存活率的影響;以5ug/mL衣霉素刺激HepG2細(xì)胞24小時(shí)造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的模型，應(yīng)用中藥解毒通絡(luò)調(diào)肝方(25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL)對其進(jìn)行干預(yù)，檢測炎癥因子IL-6、TNF-α及CRP的表達(dá)，檢測JNK2、IRE-1、NF-κB蛋白表達(dá)量。<

3、br>　　結(jié)果:1、對大鼠體質(zhì)量、飲水量及尿量的影響:西藥組、解毒通絡(luò)調(diào)肝方高、中、低劑量組體質(zhì)量雖有下降趨勢，但與正常ZL鼠組相比較而言差異仍顯著;大鼠飲水量及尿量均明顯下降，這與臨床上解毒通絡(luò)調(diào)肝方能較好的改善2型糖尿病患者飲水增多，尿量增多的癥狀相一致。2、對大鼠糖脂代謝的影響:與模型組比較，西藥組和解毒通絡(luò)調(diào)肝方高劑量組血糖顯著下降，說明西藥組和解毒通絡(luò)調(diào)肝方高劑量組在降低血糖，提高胰島素敏感性、改善抵抗方面對糖尿病大鼠有治療作

4、用;但西藥組與中藥高劑量組的糖化血清蛋白及INS與其比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮與用藥時(shí)間較短有關(guān);與模型組比較，西藥組、解毒通絡(luò)調(diào)肝方高、中、低劑量組TC、HDL-C及中藥高劑量組TG均明顯下降;其中解毒通絡(luò)調(diào)肝方高劑量組TG和TC、HDL-C較西藥組下降更為明顯，說明解毒通絡(luò)調(diào)肝方高劑量組有更好的降脂作用。3、免疫組化方面:對照組ZL鼠無高糖、高脂、肥胖應(yīng)激狀態(tài)，肝細(xì)胞漿細(xì)中無IRE1及P-IRE1、JNK及P-JNK蛋白的表達(dá)，但模型組

5、、西藥組、解毒通絡(luò)調(diào)肝方高、中、低劑量組，ZDF鼠存在高糖、高脂、肥胖應(yīng)激狀態(tài)，并且給藥前肝細(xì)胞漿中均有IRE1及P-IRE1、JNK及P-JNK蛋白的表達(dá)，證實(shí)了通過給予Purina＃5008高脂飼料，ZDF鼠可誘導(dǎo)形成糖尿病模型;同時(shí)與模型組比較給藥后西藥組、解毒通絡(luò)調(diào)肝方高、中、低劑量組肝細(xì)胞胞漿中IRE1、P-IRE1、JNK及P-JNK蛋白表達(dá)明顯減少。證實(shí)解毒調(diào)肝通絡(luò)湯及二甲雙胍均能通過減少IRE1、P-IRE1、JNK及P

6、-JNK蛋白的表達(dá)，抑制IRE1-JNK信號通路，起到改善胰島素抵抗、減少細(xì)胞凋亡的作用;給藥后解毒通絡(luò)調(diào)肝方高、中、低劑量組肝細(xì)胞胞漿中IRE1、P-IREI、JNK及P-JNK蛋白表達(dá)比西藥組均減少，且以解毒通絡(luò)調(diào)肝方中劑量組減少較為明顯，說明解毒通絡(luò)調(diào)肝方中劑量組有較好的改善抵抗，減少凋亡的作用。4、提高肝組織中IRS-1及PI3K的表達(dá)量，增加肝組織對胰島素的敏感性。5、體外細(xì)胞培養(yǎng)方面:對于HePG2細(xì)胞而言，解毒通絡(luò)調(diào)肝方1

7、2.5ug/mL、25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL，與對照組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證實(shí)上述濃度的解毒通絡(luò)調(diào)肝方無細(xì)胞毒性;HePG2細(xì)胞IL-6，TNF-α、CRP及JNK2，NF-κB及IRE-1少量表達(dá)，給予衣霉素刺激后，模型組上述炎癥因子及蛋白表達(dá)較對照組顯著升高，證實(shí)了通過給予5ug/ml衣霉素處理24小時(shí)可造成HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的模型;同時(shí)，解毒通絡(luò)調(diào)肝方高、中、低劑量組IL-6，TNF-

8、α及CRP表達(dá)與模型組比較差異顯著，其中IL-6，TNF-α的表達(dá)以中藥高劑量組降低較為明顯，證實(shí)了解毒通絡(luò)調(diào)肝方可明顯抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下HepG2細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的表達(dá);在蛋白表達(dá)方面，中藥中劑量組與高劑量組JNK2、NF-κB及中藥高中低劑量組IRE-1表達(dá)較模型組明顯減少，其中以中藥高劑量組減少較為明顯，說明中藥中劑量組與高劑量組能降低JNK2、NF-κB的表達(dá)水平，中藥高中低劑量組均可降低IRE-1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，本課題

9、的的結(jié)果同文獻(xiàn)一致，藥物干預(yù)后起到了胰島素增敏劑的作用，可減少HepG2細(xì)胞相關(guān)炎癥因子及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:1、解毒通絡(luò)調(diào)肝方能較好的改善2型糖尿病大鼠飲水量增多，尿量增多，減輕大鼠體重，降低血糖、血脂，提高胰島素的敏感性。2、解毒通絡(luò)調(diào)肝方能通過減少IRE1、P-IREI、JNK及P-JNK蛋白的表達(dá)，抑制IRE1α-JNK信號通路，同時(shí)提高IRS及PI3K的相對表達(dá)量，從而起到改善胰島素抵抗、減少細(xì)胞凋亡的作用。3、解毒