IRE1分子通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)預應激條件下對肝細胞缺氧損傷的保護機制.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）保持蛋白質(zhì)內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定的這一功能的失衡，是由多種因素引起的。這其中就包含了缺氧和氧化應激。這一功能的失衡就會導致蛋白質(zhì)折疊能力和蛋白質(zhì)負載能力之間的失衡。這些因素共同引發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERstress）以及未折疊蛋白反應（UPR）。未折疊蛋白反應（UPR）最初是作為細胞的一種適應性反應，但是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激長期存在的情況下，也能誘導細胞凋亡。衣霉素(TM)是一種常用的體外內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的誘導試劑，在一定的濃度和作用時間下，能夠誘

2、導細胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)預應激的反應而對抗缺氧對細胞的損傷作用。通過篩選未折疊蛋白反應的三條分子通路，我們重點研究IRE1通路中的下游蛋白RACK1分子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)預應激的情況下探討其蛋白和RNA水平表達是否上調(diào)。再沉默其表達，通過Western-blot和RT-PCR檢測以及對細胞凋亡率的檢測和統(tǒng)計學分析，證明RACK1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)預應激的條件下，通過IRE1通路，作為一種保護性蛋白存在于肝細胞當中。
　　實驗1．將正常人肝臟細胞HL-770

3、2分成5組，分別為A，B，C，D，E組；A組為正常對照組，其余四組正常培養(yǎng)48小時后換液（分別含衣霉素濃度為0.05，0.10,0.20,0.40μg/ml的培養(yǎng)基）培養(yǎng)48小時后換正常培養(yǎng)基，即刻轉(zhuǎn)入缺氧培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)2，4，8，16小時后再統(tǒng)一轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)6小時后觀察細胞形態(tài)并收集細胞測凋亡值。
　　結(jié)論：
　　根據(jù)普通光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察結(jié)果和流式細胞檢測結(jié)果顯示D、E兩組細胞全部死亡；B組細胞與正常對照無

4、差異；C組細胞凋亡率為20％。將衣霉素濃度0.1μg/ml，缺氧培養(yǎng)4小時再復氧培養(yǎng)6小時作為正常肝細胞缺氧模型的標準時限。
　　實驗2.根據(jù)實驗1的模型，將細胞分為4組：正常對照組（control組）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)預應激組（ERS組）；缺氧損傷組（H/R組）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)預應激+缺氧損傷組（ERS+H/R組）。收集各組細胞提取蛋白質(zhì)，通過Western-blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異性分子伴侶GRP78和UPR三條通路的蛋白ATF6，PERK以

5、及RACK1的表達。
　　結(jié)論：
　　在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)預應激的條件下，GRP78表達均上調(diào)，證明衣霉素成功誘導了肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)預應激的表達。UPR三條通路的蛋白分子ATF6，PERK以及RACK1的表達在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)預應激的情況下有著不同程度的提高。均比正常對照和單純?nèi)毖鯎p傷組的表達要高。有統(tǒng)計學意義。通過GRP78這一標志性蛋白的提升我們肯定衣霉素對肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)預應激的成功誘導，UPR三條通路的蛋白的表達也不同程度提高，本課題重點研究IR

6、E1下游分子RACK1對肝細胞缺氧的保護機制。
　　實驗3．根據(jù)實驗1的模型，再將培養(yǎng)的人肝細胞分為5組：A組：正常對照；B組：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激+缺氧復氧損傷組；C組：單純內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激組；D組：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激+空載轉(zhuǎn)染組；E組：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激+siRNA轉(zhuǎn)染組。收集各組細胞，以流式細胞儀檢測細胞凋亡，Western-bloting及RT-PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異蛋白RACK1表達水平，并通過透射電鏡觀察各組細胞超微結(jié)構(gòu)改變。
　　結(jié)論：