缺血條件下間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號(hào)通路與旁分泌效應(yīng)研究.pdf

1、一般認(rèn)為，機(jī)體缺少心肌損傷修復(fù)和冉生的有效機(jī)制，心肌細(xì)胞受損后不能再生。心肌梗死導(dǎo)致心肌細(xì)胞不可逆的丟失，形成瘢痕并最終導(dǎo)致充血性心力衰竭的發(fā)生。傳統(tǒng)的藥物、介入治療等雖然保護(hù)了心功能，但并不能從根本上逆轉(zhuǎn)心血管疾病引起的心肌細(xì)胞數(shù)量減少；心臟移植則由于供體來(lái)源少、風(fēng)險(xiǎn)大、排斥反應(yīng)等原因難以廣泛開(kāi)展。干細(xì)胞治療有可能取代受損心肌細(xì)胞，增加有功能的心肌細(xì)胞數(shù)量，并促進(jìn)新的血管生成恢復(fù)血運(yùn)，為心肌梗死的治療開(kāi)辟了一條新途徑。
　　

2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，由于具有其它細(xì)胞不具備的許多優(yōu)點(diǎn)而成為心血管疾病細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞。目前認(rèn)為MSCs通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)心臟損傷的修復(fù)：植入心臟并分化為心臟構(gòu)成細(xì)胞、與心臟細(xì)胞融合、分泌心肌保護(hù)和血管生成因子發(fā)揮旁分泌作用。但是MSCs移植到梗死心臟后的低存活率嚴(yán)重制約以上效應(yīng)的發(fā)揮，降低了細(xì)胞治療的療效。因此，清楚梗死心臟中影響MSCs存活的不利因素及其誘導(dǎo)MSCs死亡的機(jī)制對(duì)于最大程度的發(fā)揮

3、MSCs心臟修復(fù)效應(yīng)非常必要。
　　 本課題組先前曾報(bào)道，缺氧、血清饑餓（H/SD）激活線粒體途徑誘導(dǎo)MSCs發(fā)生細(xì)胞凋亡；而溶血磷脂酸（LPA）可以激活細(xì)胞中PI3K/Akt、ERK1/2信號(hào)通路，抑制H/SD誘導(dǎo)的MSCs凋亡。研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ERS）也參與了缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而ERS是否參與H/SD誘導(dǎo)的MSCs凋亡還不清楚。此外，我們還發(fā)現(xiàn)MSCs在H/SD條件下的條件培養(yǎng)液（MSCs-CM）具有促進(jìn)心肌細(xì)胞肥

4、大的效應(yīng)，而MSCs-CM對(duì)心臟成纖維細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響也不清楚。因此本研究致力于探討：（1）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)在缺血誘導(dǎo)的MSCs凋亡的作用，以及LPA對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的干預(yù)及其干預(yù)的機(jī)制，以期為提高M(jìn)SCs移植存活率提供新的靶點(diǎn)。（2）MSCs-CM對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響以及發(fā)揮作用的效應(yīng)因子，為臨床缺血性心臟病的纖維化干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本研究包括以下兩部分內(nèi)容：
　　 1.LPA對(duì)缺氧、缺血清誘導(dǎo)的

5、MSCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響
　　 （1）缺氧、血清饑餓（H/SD）聯(lián)合處理模擬體內(nèi)缺血微環(huán)境誘導(dǎo)大鼠MSCs凋亡。H/SD處理后，MSCs中的CHOP和Caspase-12 mRNA表達(dá)明顯上升，而GRP78 mRNA表達(dá)顯著降低；剪切的XBP1蛋白表達(dá)和eIF2α的磷酸化水平明顯升高；而且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白Procaspase-12活化剪切和CHOP蛋白表達(dá)也明顯升高。以上結(jié)果表明H/SD誘導(dǎo)MSCs中發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)

6、。
　　 （2）H/SD誘導(dǎo)MSCs中p38 MAPK磷酸化水平明顯升高，而p38抑制劑SB202190不但能明顯抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放和膜電位降低，還能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Procaspase-12剪切活化，表明p38活化同時(shí)激活了線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Caspase-12凋亡通路。但SB202190增強(qiáng)了凋亡蛋白CHOP的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。以上結(jié)果提示在H/SD刺激的MSCs中p38活化可能發(fā)揮促凋亡和抗凋亡雙重作用。
　　 （3

7、）LPA能夠抑制H/SD誘導(dǎo)的p38活化、Procaspase-12剪切活化以及CHOP蛋白表達(dá)，并且LPA對(duì)p38活化的抑制是通過(guò)激活LPA1/3/ERK1/2/MKP-1信號(hào)途徑發(fā)揮作用的，而此過(guò)程與PI3K/Akt信號(hào)途徑無(wú)關(guān)。
　　 以上研究結(jié)果表明，除線粒體凋亡途徑外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑也參與H/SD誘導(dǎo)的MSCs凋亡；而LPA可以通過(guò)激活LPA1/3/ERK1/2/MKP-1信號(hào)途徑來(lái)抑制p38活化，從而抑制D38介

8、導(dǎo)的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑。
　　 2.MSCs旁分泌對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響及效應(yīng)因子研究
　　 （1）MSCs缺氧、缺血清6 h條件培養(yǎng)液（MSCs-CM）能夠明顯的抑制常氧和缺氧培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成，并且發(fā)現(xiàn)<30kD分子量組分是MSCs-CM中的主要效應(yīng)組分。
　　 （2）H/SD可以誘導(dǎo)MSCs中炎癥因子IL-1β、TNF-α轉(zhuǎn)錄明顯上升，但并不能誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α分

9、泌到細(xì)胞外。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，H/SD雖然可以誘導(dǎo)IL-1β前體蛋白Pro-IL-1β翻譯上調(diào)并剪切成熟，但成熟的IL-1β需要外源性ATP刺激才能分泌到胞外；而H/SD刺激的MSCs中存在TNF-α翻譯抑制機(jī)制。以上結(jié)果表明，缺血條件下IL-1β和TNF-α在MSCs旁分泌中的作用可以忽略。
　　 （3）H/SD可以誘導(dǎo)MSCs中抗炎癥因子IL-10轉(zhuǎn)錄和分泌升高。蛋白酶體抑制劑MG132和細(xì)菌脂多糖（LPS）能夠明顯增強(qiáng)H/

10、SD誘導(dǎo)的IL-10轉(zhuǎn)錄和分泌。并且體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-10對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖以及膠原表達(dá)都有明顯的抑制作用。以上結(jié)果表明，IL-10可能在。MSCs旁分泌抑制心臟纖維化過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　 綜上所述，缺血條件下，MSCs能夠通過(guò)旁分泌作用抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，發(fā)揮抗纖維化作用，并且效應(yīng)分子為<30kD組分。MSCs不能分泌IL-1β和TNF-α，它們?cè)贛SCs旁分泌中的作用可以忽略。IL-10能夠抑制心臟成纖